邵偉偉，蘭建云，宋 曙，郝蘭香，鄒 琳

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院：1.病理科；2.內(nèi)分泌科 224000)

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·論 著·

肺腺癌中表皮生長因子受體基因突變及表皮生長因子受體2、血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及與臨床的關(guān)系

邵偉偉1，蘭建云1，宋 曙1，郝蘭香2，鄒 琳1

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院：1.病理科；2.內(nèi)分泌科 224000)

目的 探討肺腺癌中表皮生長因子受體(EGFR)基因突變及人表皮生長因子受體2(HER-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系。方法 采用ARMS-PCR法檢測10例正常肺組織及49例肺腺癌組織的EGFR基因突變的情況，同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測HER-2和VEGF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 (1)肺腺癌組織標(biāo)本EGFR基因突變率及HER-2、VEGF蛋白表達(dá)率均比正常肺組織高(χ2=10.875 6,P=0.001；χ2=12.456 0,P=0.000；χ2=6.775 2,P=0.009)。(2)EGFR突變的發(fā)生與患者性別、是否吸煙有關(guān)(P<0.05)，與年齡、腫塊大小、腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、有無胸膜浸潤無關(guān)(P>0.05)。HER-2與VEGF蛋白表達(dá)均與腫瘤的分化程度、腫塊大小、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無胸膜浸潤相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、有無吸煙史無關(guān)(P>0.05)。(3)肺腺癌中HER-2與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.376 4,P=0.007 7)。結(jié)論 EGFR突變與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，其在女性、非吸煙者的高表達(dá)有重要的臨床意義。HER-2和VEGF在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用，有助于臨床評估預(yù)后，并為肺腺癌的新分子靶向治療提供理論依據(jù)。

肺腺癌； 表皮生長因子受體； 人表皮生長因子受體2； 血管內(nèi)皮生長因子

隨著人口老齡化及吸煙(主動(dòng)及被動(dòng))、大氣污染等因素的影響，原發(fā)性肺癌已居我國惡性腫瘤的首位，其中80%是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[1]。以往研究認(rèn)為NSCLC中鱗狀細(xì)胞癌比較多見，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)肺腺癌的發(fā)病率正逐年升高，EGFR-TKI的使用已成為一線藥物治療的首選。肺癌的發(fā)生發(fā)展過程同時(shí)涉及到腫瘤細(xì)胞的異常增殖及血管的異常新生，因此通過對提取組織的DNA進(jìn)行擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)法(ARMS-PCR)檢測肺腺癌中表皮生長因子受體(EGFR)的第18、19、20、21號外顯子是否存在突變，同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測人表皮生長因子受體2(HER-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白的表達(dá)情況，探討它們之間的相互關(guān)系及與臨床病理因素間的關(guān)系，為肺腺癌的預(yù)后評估及治療提供一些理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2015年6月鹽城市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的肺腺癌組織標(biāo)本49例，全部病例術(shù)前均未進(jìn)行放化療，經(jīng)2位高年資主任醫(yī)師重新閱片明確診斷與臨床分期。取10例周邊正常的肺組織作為對照，所有標(biāo)本均采用中性福爾馬林固定后常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因突變檢測 對標(biāo)本的DNA采用ARMS-PCR法檢測EGFR的第18、19、20、21基因突變。所用試劑購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。實(shí)驗(yàn)步驟：(1)提取組織DNA。(2)PCR擴(kuò)增。(3)分析擴(kuò)增曲線。

1.2.2 HER-2及VEGF免疫組織化學(xué)檢測 HER-2及VEGF兔抗人單克隆抗體及SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，均為即用型。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、組織抗原修復(fù)、10%正常血清封閉后按說明書操作步驟進(jìn)行，顯微鏡控制下DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。使用PBS代替1抗處理的切片作為陰性對照，已知陽性片作為陽性對照。

1.2.3 結(jié)果判斷 (1)EGFR突變判讀：按照試劑說明書上的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀：根據(jù)目前歐美國家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)[2],HER-2陽性染色定位于細(xì)胞膜上，呈棕黃色或棕褐色顆粒，無細(xì)胞膜著色為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)大于10%且細(xì)胞膜為非連續(xù)完整著色為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)大于10%且細(xì)胞膜為中等強(qiáng)度連續(xù)完整著色為(++)，陽性細(xì)胞數(shù)大于10%且細(xì)胞膜為強(qiáng)而連續(xù)完整著色為(+++)。VEGF陽性染色定位于細(xì)胞漿中，呈棕黃或棕褐色，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)以上腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)大于或等于50%為(+++)，49%～26%為(++)，25%～6%為(+)，小于或等于5%為(-)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)和Fisher-exact檢驗(yàn)，采用Spearman等級相關(guān)分析兩指標(biāo)間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種組織標(biāo)本檢測結(jié)果比較 正常肺組織標(biāo)本無EGFR基因突變，49例肺腺癌有28例出現(xiàn)突變，突變集中在第19、21號外顯子，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.875 6,P=0.001)。HER-2在正常肺組織無表達(dá)，在癌組織中表達(dá)率為61.22%(30/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.456 0,P=0.000)。VEGF在正常肺組織中有1例呈中等強(qiáng)度表達(dá)，在癌組織中表達(dá)率為55.01%(27/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.775 2,P=0.009)。見表1和圖1～3。

2.2 各指標(biāo)與臨床病理因素間的相關(guān)性 EGFR基因突變的發(fā)生與患者性別、是否吸煙有關(guān)(P<0.05)，與腫塊大小、年齡、腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、有無胸膜浸潤無關(guān)(P>0.05)。HER-2與VEGF蛋白表達(dá)均與腫瘤的分化程度、腫塊大小、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無胸膜浸潤有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、有無吸煙史無關(guān)(P>0.05)。見表2。

圖1 正常肺組織HER-2陰性表達(dá)

圖2 中分化肺腺癌組織HER-2在細(xì)胞膜的表達(dá)

圖3 低分化肺腺癌組織VEGF在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)

標(biāo)本類型nEGFR無突變有突變PHER-2陰性(-)陽性(+)PVEGF陰性(-)陽性(+)P正常肺組織101000.0011000.000910.009肺腺癌組織49212819302227

表2 各指標(biāo)與臨床病理因素間的相關(guān)性(n)

續(xù)表2 各指標(biāo)與臨床病理因素間的相關(guān)性(n)

2.3 肺腺癌組織HER-2與VEGF表達(dá)的相關(guān)性 49例患者HER-2與VEGF同時(shí)陽性表達(dá)者有21例，同時(shí)陰性表達(dá)者有13例，兩者具有相關(guān)性(χ2=6.941 0，P=0.008)。Spearman等級相關(guān)分析顯示，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.376 4,P=0.007 7)。

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生離不開細(xì)胞周期的異常轉(zhuǎn)化，肺癌的高發(fā)病率及高病死率均與細(xì)胞周期因子的異常變化密切相關(guān)。表皮生長因子(EGF)又稱為HER-1，具有酪氨酸激酶活性，無活性狀態(tài)下以單體形式存在，與相應(yīng)配體(EGF等)結(jié)合后以二聚體形式參與腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[3-4]。在肺腺癌組織中EGF含量遠(yuǎn)超過正常肺組織，因此EGFR與EGF結(jié)合，通過過表達(dá)、基因擴(kuò)增及基因突變等形式表現(xiàn)為活性增高，從而激活酪氨酸蛋白激酶促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。本研究也證實(shí)，正常肺組織標(biāo)本無EGFR基因突變，肺腺癌組織的突變率遠(yuǎn)高于正常組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。臨床使用酪氨酸激酶抑制劑(吉非替尼、厄洛替尼等)正是通過競爭性地結(jié)合酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域上的腺苷三磷酸，達(dá)到抑制EGFR下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到阻斷EGFR誘導(dǎo)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，女性患者EGFR突變率(80.95%)遠(yuǎn)高于男性(39.29%)，原因可能是由于EGFR突變的發(fā)生與患者雌激素水平有關(guān)。有研究認(rèn)為雌激素受體和EGFR通路間存在相互作用[5]。非吸煙患者突變率(68.75%)高于吸煙患者(35.29%)，提示雖然吸煙是已被公認(rèn)是發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)因素之一，但煙草不是EGFR突變的致癌劑。本研究未發(fā)現(xiàn)EGFR突變與其他臨床因素間的關(guān)系，可能是由于在肺腺癌惡性生長、轉(zhuǎn)移過程中，EGFR突變不是唯一的影響因素。

HER-2是一種原癌基因，具有酪氨酸激酶的活性，其數(shù)量與結(jié)構(gòu)的異常變化可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其高表達(dá)與癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成有關(guān)[6]。已有報(bào)道在肺癌、乳腺癌、胃癌中存在HER-2的過表達(dá)[7-9]。本研究結(jié)果顯示，正常肺組織無HER-2蛋白表達(dá)，但在癌組織中其表達(dá)率為61.22%(30/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肺腺癌組織陽性表達(dá)率的差異與患者性別、年齡、有無吸煙無關(guān)，但是與腫瘤的低分化、晚期臨床分期、較大體積、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜浸潤有關(guān)。本組認(rèn)為，由于HER-2蛋白在正常情況下處于非激活狀態(tài)，但在受到體內(nèi)外某些因素作用時(shí)其配體表達(dá)增多，致使HER-2過多地與配體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，多種核轉(zhuǎn)錄因子被活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞無序增殖，所以在體積大、臨床分期晚、分化程度差的組織中高表達(dá)。腫瘤的惡性進(jìn)展、侵襲能力的獲得與新生血管數(shù)目增多密切相關(guān)。本研究提示HER-2與VEGF蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，說明VEGF通過誘導(dǎo)新生血管，降低血管通透性，HER-2通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路加強(qiáng)細(xì)胞增殖速度及能力，兩者協(xié)同作用促進(jìn)了癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵襲胸膜的能力。

VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性致分裂原，由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，在正常組織中低表達(dá)，但在惡性腫瘤中瘤細(xì)胞可大量分泌VEGF。一方面其在腫瘤的生長、發(fā)展過程中起重要作用，另一方面在血管的形成和發(fā)育過程中起正向調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是誘導(dǎo)腫瘤血管形成特異性最高的生長因子之一[10]。在多種實(shí)體腫瘤中已被證實(shí)存在VEGF的過表達(dá)[11-13]。本研究結(jié)果證實(shí)，VEGF在肺腺癌組織的表達(dá)顯著高于正常肺組織，在低分化、高TNM分期、腫塊大于3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜浸潤的肺腺癌組織中也高表達(dá)，與國內(nèi)外研究基本一致[14-15]。本組認(rèn)為肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，VEGF通過與其受體結(jié)合，一方面在直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、遷移的基礎(chǔ)上加快了癌細(xì)胞生長，另一方面在加快血管基底膜降解、提高血管通透性的基礎(chǔ)上，有利于癌細(xì)胞的脫落轉(zhuǎn)移，因此在晚期臨床分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫塊較大、出現(xiàn)胸膜浸潤的患者其表達(dá)較高。

肺癌的治療現(xiàn)已進(jìn)入分子化、個(gè)體化階段，這就要求盡可能多地了解在其發(fā)生、發(fā)展過程中所涉及到的相關(guān)分子，希望通過本研究能夠?yàn)榻窈蠓伟┑姆肿影邢蛑委?、預(yù)后評估提供一些理論依據(jù)。

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Lorrelation of gene mutation of EGFR,the expressions of HER-2,VEGF in lung adenocarcinoma and clinical pathological factors

SHAOWeiwei1,LANJianyun1,SONGShu1,HAOLanxiang2,ZOULin1

(1.DepartmentofPathology；2.DepartmentofEndocrinology,theFirstPeople′sHospitalofYancheng,Yancheng,Jiangsu224006,China)

Objective To investigate the gene mutation of epithelial growth factor receptor(EGFR) and the expressions of human epiderma1 growth factor receptor 2(HER-2) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in lung adenocarcinoma and their relationships with the clinical pathological factors.Methods ARMS-PCR method was used to detect the gene mutation of EGFR in 49 lung adenocarcinoma specimens and 10 normal tissue specimens．Immunohistochemical method was also used to detect the expressions of the HER-2 and VEGF in them.Results (1) The mutation rates of EGFR and the positive rates of HER-2 and VEGF in lung adenocarcinoma were significantly higher than those in the normal tissues(P<0.01).(2) The occurs of EGFR mutation were correlated with sex and the smoking habit(P<0.05);but not correlated with age,the size of tumor,differential,lymph nodes metastasis,TNM stages and pleural invasion(P>0.05).The HER-2 and VEGF protein expressions in lung adenocarcinoma were correlated with differential,the size of tumor,TNM stages,lymph nodes metastasis and pleural invasion(P<0.05);but not correlated with sex,age,and the smoking habit(P>0.05).(3) The expressions of HER-2 and VEGF protein in the lung adenocarcinoma were positively correlated with each other(P<0.01).Conclusion EGFR mutation is closely related to the occurrence of lung adenocarcinoma,its high expressions in the women,non smoking people have important clinical significance.HER-2 and VEGF could promote the lung adenocarcinoma′s occurrence,development and transfer.They could be used to evaluate the patients′prognosis,and provide new molecular targeted therapy.

lung adenocarcinoma; epithelial growth factor receptor; epiderma1 growth factor receptor 2; vascular endothelial growth factor

邵偉偉，女，主治醫(yī)師，主要從事臨床腫瘤病理研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.016

A

1673-4130(2016)20-2843-04

2016-04-22

2016-06-17)