孫寧娜，李洪春

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 221002)

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·論 著·

尿血紅蛋白對(duì)芐索氯銨法定量測(cè)定尿蛋白的干擾評(píng)價(jià)

孫寧娜，李洪春△

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 221002)

目的 評(píng)價(jià)尿血紅蛋白對(duì)芐索氯銨法定量測(cè)定尿蛋白的影響。方法 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的EP7-A2方案，配制不同濃度血紅蛋白的尿液標(biāo)本做劑量-效應(yīng)試驗(yàn)，同時(shí)收集50例不同隱血程度的尿液標(biāo)本做臨床標(biāo)本的偏倚試驗(yàn)；尿蛋白定量在DPP羅氏生化工作站采用芐索氯銨法檢測(cè)，與磺基水楊酸法進(jìn)行比較。結(jié)果 劑量-效應(yīng)試驗(yàn)顯示，當(dāng)尿血紅蛋白濃度達(dá)0.2 g/L時(shí)即對(duì)芐索氯銨法測(cè)定尿蛋白產(chǎn)生顯著性干擾(P<0.05)；臨床標(biāo)本的偏倚試驗(yàn)顯示，不同程度的隱血對(duì)芐索氯銨法測(cè)定尿蛋白產(chǎn)生明顯的正干擾。結(jié)論 重視尿隱血陽性和/或含有紅細(xì)胞的尿液標(biāo)本，在采用芐索氯銨法測(cè)定尿蛋白時(shí)應(yīng)評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性，必要時(shí)使用磺基水楊酸法進(jìn)行確認(rèn)。

血紅蛋白； 芐索氯銨法； 尿蛋白定量； 干擾

尿蛋白含量是評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收功能的重要指標(biāo)。尿蛋白的測(cè)定經(jīng)歷了Esbach法、Hoffman稱重法、比色法、濁度法、染料結(jié)合法、免疫法等，但每種方法均有一定優(yōu)缺點(diǎn)，存在靈敏度高低不同，對(duì)清蛋白、球蛋白反應(yīng)不一致等問題，尤其“干擾”是影響尿蛋白測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素，如尿液的pH值、混濁度、細(xì)胞、藥物等[1-3]。本研究參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)《臨床生化干擾測(cè)試-批準(zhǔn)指南(第2版)》(EP7-A2)方案評(píng)價(jià)尿血紅蛋白對(duì)芐索氯銨法定量測(cè)定尿蛋白的干擾性。

1 材料與方法

1.1 一般材料 (1)劑量-效應(yīng)試驗(yàn)標(biāo)本：根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)收集臨床尿液標(biāo)本3份(各10 mL)，要求蛋白定性(愛科來干化學(xué))為標(biāo)本1(-)、標(biāo)本2(±)、標(biāo)本3(+)，隱血試驗(yàn)(愛科來干化學(xué))均為陰性，鏡檢無紅細(xì)胞，外觀清、淡黃色，pH約6.0。(2)偏倚試驗(yàn)的臨床標(biāo)本：根據(jù)試驗(yàn)要求選取臨床尿液標(biāo)本共50份，外觀清、淡黃色，pH約6.0，分別為隱血(-)、蛋白(-、±、+、++、+++)；隱血(±)、蛋白(-、±、+、++、+++)；隱血(+)、蛋白(-、±、+、++、+++)；隱血(++)、蛋白(-、±、+、++、+++)；隱血(+++)、蛋白(-、±、+、++、+++)各2份，檢測(cè)前1 500 r/min離心3 min。

1.2 儀器與試劑 (1)DPP羅氏生化工作站(德國)，Sysmex XE-2100D全自動(dòng)血液分析儀(日本)；722分光光度計(jì)(上海分析儀器廠，本年度通過徐州市計(jì)量局檢定)。(2)芐索氯銨法試劑盒購置于羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；磺基水楊酸購自(上海)研域生物科技有限公司，1 mg/mL人血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液購自(上海)廣銳生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血紅蛋白液制備 挑選臨床血常規(guī)標(biāo)本1份，采用生理鹽水充分洗滌5次，棄上清液，使用去離子水破壞紅細(xì)胞并調(diào)整血紅蛋白(血細(xì)胞分析測(cè)定)濃度至40 g/L。

1.3.2 配制不同濃度血紅蛋白 配制含不同濃度0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的尿液標(biāo)本。

1.3.3 尿蛋白濃度測(cè)定 按標(biāo)準(zhǔn)操作程序在DPP生化分析儀上使用芐索氯銨法測(cè)定尿蛋白，為平衡漂移，按順反順序測(cè)定3次，取均值。采用試劑盒內(nèi)配帶的定標(biāo)液定標(biāo)，檢測(cè)時(shí)所使用儀器均在控。磺基水楊酸法測(cè)定尿蛋白濃度，參照張耀廷等[4]的方法，為平衡誤差，每份標(biāo)本測(cè)3次取均值。

2 結(jié) 果

2.1 劑量-效應(yīng)試驗(yàn) 當(dāng)血紅蛋白濃度達(dá)0.2 g/L時(shí)，即對(duì)芐索氯銨法尿蛋白檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾,與未加血紅蛋白的尿蛋白結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著尿血紅蛋白濃度的增加，尿蛋白測(cè)定值呈不同程度的假性增高，與血紅蛋白濃度呈“劑量依賴”趨勢(shì)。尿液中不同濃度的血紅蛋白對(duì)磺基水楊酸法測(cè)定尿蛋白未產(chǎn)生明顯干擾，與未加血紅蛋白的尿蛋白結(jié)果比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、2。

表1 不同濃度血紅蛋白對(duì)芐索氯銨法尿蛋白測(cè)定的干擾±s,mg/L)

注：與未加血紅蛋白比較，*P<0.05。

表2 不同濃度血紅蛋白對(duì)磺基水楊酸法尿蛋白測(cè)定的干擾±s,mg/L)

2.2 臨床標(biāo)本的偏倚試驗(yàn) 臨床不同隱血程度的尿液標(biāo)本對(duì)芐索氯銨法尿蛋白定量檢測(cè)，具有明顯的正干擾。見圖1。

圖1 芐索氯銨法與磺基水楊酸法測(cè)定不同程度隱血的尿蛋白

3 討 論

正常尿液中蛋白含量甚微，經(jīng)腎小球正常濾過的相對(duì)小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)在腎小管幾乎全部被重吸收，當(dāng)炎性、毒素等原因?qū)е履I小球的濾過膜發(fā)生改變或腎小管的重吸收能力障礙時(shí)，排出體外的尿液有含量不等、相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)，可以用于判斷腎病發(fā)生與否，并可反映腎臟受損程度。有關(guān)隨機(jī)尿蛋白的檢測(cè)，臨床實(shí)驗(yàn)室常用定性分析，由于尿液中蛋白質(zhì)在24 h不同時(shí)間段排泄率不同，且與運(yùn)動(dòng)、情緒、體位等也有一定關(guān)系，所以需要做24 h尿蛋白總量測(cè)定，其準(zhǔn)確測(cè)量的結(jié)果有助于臨床對(duì)腎臟疾病的診斷及療效觀察[5]。芐索氯銨法檢測(cè)尿液蛋白質(zhì)的原理是將芐索氯銨作為蛋白質(zhì)變性劑，使尿液中蛋白質(zhì)變性沉淀，在404 nm比濁，從而測(cè)定蛋白含量，對(duì)清蛋白及球蛋白的靈敏度無差異，分析線性達(dá)2.0 g/L是臨床實(shí)驗(yàn)室用于測(cè)定尿蛋白的成熟方法，在干化學(xué)法測(cè)定腦脊液的蛋白定量中應(yīng)用更為廣泛。也是DPP羅氏生化工作站的配套方法，磺基水楊酸法既可用于尿蛋白定性，也可用于定量，并被推薦為檢查尿蛋白的確證試驗(yàn)，但僅限手工操作，不利于自動(dòng)化，故臨床很少采用[6]。

當(dāng)腎臟功能障礙或因其他原因?qū)е旅谀蛳到y(tǒng)受損時(shí)，除含量不等的尿蛋白隨尿液排出體外，尿液內(nèi)也會(huì)伴隨或多或少紅細(xì)胞出現(xiàn)，鏡檢紅細(xì)胞顯示數(shù)個(gè)、數(shù)十個(gè)，甚至數(shù)百個(gè)，潛血試驗(yàn)呈陰性或不同程度的陽性。尿紅細(xì)胞或尿血紅蛋白對(duì)尿蛋白測(cè)定的干擾已早有報(bào)道，但大多數(shù)是評(píng)價(jià)尿蛋白的定性檢測(cè)[7-8]。由于尿蛋白定量分析屬于臨床化學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目，在進(jìn)行尿蛋白定量測(cè)定時(shí)即使通過離心可排除紅細(xì)胞干擾，但常會(huì)忽略尿液中血紅蛋白的存在。芐索氯銨法測(cè)定尿蛋白的試劑說明書中明確指出，尿隱血陽性對(duì)該法有干擾，但無詳細(xì)注明尿液血紅蛋白多少含量會(huì)造成多大程度的干擾。本研究參照CLSI的EP7-A2文件，配制不同血紅蛋白濃度的尿液標(biāo)本，結(jié)果表明，血紅蛋白達(dá)0.2 g/L時(shí)(尿液外觀無明顯改變，潛血試驗(yàn)“+”)即對(duì)芐索氯銨法測(cè)定尿蛋白造成明顯的正干擾，且隨血紅蛋白濃度的增加呈明顯的正相關(guān)性。

尿蛋白定量檢測(cè)是臨床評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)之一，準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果有助于臨床對(duì)腎臟疾病的輔助診斷、療效觀察及預(yù)后判斷。當(dāng)尿液合并有紅細(xì)胞或隱血試驗(yàn)呈陽性時(shí)，一定要重視其對(duì)尿蛋白分析結(jié)果的干擾，尤其是尿蛋白定量測(cè)定。

[1]張會(huì)芬.改良的磺基水楊酸-硫酸鈉比濁法測(cè)定腦脊液蛋白的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,26(5):343-345.

[2]苗靜,王學(xué)晶,徐國賓.鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合法與雙縮脲比色法測(cè)定嘌呤霉素腎病大鼠尿中總蛋白濃度的比較[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(4):553-555.

[3]周華勝,李土珍.兩種不同方法檢測(cè)尿蛋白的比較分析[J].河北醫(yī)學(xué),2010,16(10):1276-1278.

[4]張耀廷，郭巖，辛暨華，等.應(yīng)用磺基水楊酸法測(cè)定蛋白定量[J].中國生物制品學(xué)雜志，2001,14(4):247-248.

[5]李變，李南方，張菊紅，等.高血壓患者不同體位下的尿液分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013,10(16):3-5.

[6]Seehusen DA,Reeves MM,Fomin DA.Cerebrospinal fluid analysis[J].Am Fam Physician,2003,68(6):1103-1108.

[7]蔣翠霞，師勇，余秀瑾,等.尿干試紙條檢測(cè)與尿鏡檢結(jié)果比較分析[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2009,3(23):88-89.

[8]蘇慶軍,韓曄暉,陳建國,等.高濃度血紅蛋白對(duì)尿蛋白干化學(xué)檢測(cè)的影響[J].山西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(7):650-651.

Evaluation of the interference of hemoglobin to the determination of protein in urine by benzethonium chloride

SUNNingna,LIHongchun△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Objective To evaluate the interference of occult blood in urine (urinary hemoglobin) and to determine the protein in urine by benzethonium chloride.Methods By reference to EP7-A2 of CLSI,urine containing different concentrations of hemoglobin were preparated to produce the "dose-effect curve",while 50 cases of clinical urine with varying degrees of occult blood were collected for "clinical sample bias test".Urinary protein was quantified by benzyl chloride in DPP roche comparing with sulfosalicylic acid method.Results When the urinary hemoglobin was 0.2 g/L or higher,the determined result of urinary protein of urinary protein would be significantly interfered by benzethonium chloride method.The "clinical sample bias test"showed that clinical urine with different degrees of occult blood caused positive interference to the determination of protein by benzethonium chloride.Conclusion Urine samples with occult blood and /or containing red blood cells should be emphasized and evaluate the accuracy when the urinary protein is quantified by benzyl chloride.If necessary,it should be confirmed by sulfosalicylic acid.

hemoglobin; benzethonium chloride method; urinary protein; interference

孫寧娜，女，技師，主要從事臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.013

A

1673-4130(2016)20-2836-02

2016-03-16

2016-06-16)