譚 婕，吳建華，王江平，鄒俊清，明安萍

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430061)

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·論 著·

2型糖尿病患者糖原合成酶激酶3β的表達(dá)及活性

譚 婕1，吳建華2△，王江平2，鄒俊清2，明安萍2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430061)

目的 探討糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)在2型糖尿病患者和健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)及活性水平。方法 運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測30例2型糖尿病血糖未控制患者(實(shí)驗(yàn)1組)、30例2型糖尿病血糖控制患者(實(shí)驗(yàn)2組)和30例健康者(健康對照組)外周血單個(gè)有核細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)及活性水平，并分析其結(jié)果。結(jié)果 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高(P<0.05),實(shí)驗(yàn)1組GSK-3β活性水平比健康對照組和實(shí)驗(yàn)2組升高(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)2組GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)1組男性GSK-3β活性水平比健康對照組男性升高(P<0.05)。結(jié)論 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白高表達(dá)。經(jīng)藥物治療后血糖控制者GSK-3β蛋白仍高表達(dá)，但活性水平明顯下降。2型糖尿病血糖未控制男性患者GSK-3β活性水平明顯增高。

2型糖尿?。?外周血單個(gè)核細(xì)胞； 糖原合成酶激酶3β

糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一種遺傳保守的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期代謝、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等[1-3]。目前已知GSK-3β是細(xì)胞內(nèi)胰島素、生長因子等多種信號途徑的交匯點(diǎn)，具有廣泛的底物(包括多種轉(zhuǎn)錄因子)，參與多種信號的負(fù)調(diào)控[2-4]。GSK-3β在機(jī)體的表達(dá)可能會影響到胰島素細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此其在2型糖尿病患者體內(nèi)的異常表達(dá)成為研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要標(biāo)志物?，F(xiàn)采用ELISA法檢測2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)及活性，探討其與2型糖尿病患者病情變化的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年5～10月就診于該院并經(jīng)生化檢查結(jié)合臨床癥狀確診為2型糖尿病的患者60例，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病專家委員會提出的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)(1999)。根據(jù)血糖控制情況分為2組，實(shí)驗(yàn)1組為血糖未控制患者，共30例，男15例，女15例，平均年齡61.2(47～77)歲；實(shí)驗(yàn)2組為血糖控制者，共30例，男15例，女15例，平均年齡57.5(26～83)歲。健康對照組為該院體檢中心的體檢健康者，共30例，男15例，女15例，平均年齡55.7(26～86)歲，無糖尿病史。排除糖尿病急性并發(fā)癥，心、肝、肺及非糖尿病性神經(jīng)病變等急性發(fā)作者，急、慢性感染，惡性腫瘤等。所有研究對象均清晨抽取空腹靜脈血，EDTA抗凝血2 mL，肝素抗凝血2 mL，采用肝素抗凝血做相關(guān)生化檢查，使用EDTA抗凝血做糖化血紅蛋白檢測，在采血4 h內(nèi)從剩余的EDTA抗凝血中提取外周血單個(gè)有核細(xì)胞。3組研究對象的年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 吸取EDTA抗凝血1 mL，使用Solarbio公司的人外周血淋巴細(xì)胞分離液提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞，約取2×106個(gè)細(xì)胞，使用Solarbio公司的白細(xì)胞裂解液充分裂解淋巴細(xì)胞，把吹打之后的液體轉(zhuǎn)移至EP管中，于-60 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 ELISA法檢測 采用 ELISA 雙抗體夾心法對標(biāo)本中GSK-3β蛋白及活性水平進(jìn)行定量分析。操作步驟嚴(yán)格按武漢華聯(lián)科生物科技有限公司提供的試劑盒使用說明書進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人GSK-3β蛋白及活性水平。

表1 3組研究對象的一般資料結(jié)果比較±s)

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病患者和健康者GSK-3β蛋白及活性水平結(jié)果比較 2型糖尿病患者GSK-3β蛋白水平比健康對照者升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但GSK-3β活性水平與健康對照者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 糖尿病患者和健康者GSK-3β蛋白及活性水平結(jié)果比較±s)

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

2.2 3組研究對象GSK-3β蛋白及活性水平結(jié)果比較 實(shí)驗(yàn)1組GSK-3β活性水平比健康對照組和實(shí)驗(yàn)2組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)2組GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組研究對象GSK-3β蛋白及活性水平結(jié)果比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較，△P<0.05。

2.3 3組研究對象不同性別GSK-3β蛋白及活性水平結(jié)果比較 GSK-3β蛋白水平在3組不同性別者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但實(shí)驗(yàn)1組男性GSK-3β活性水平比健康對照組男性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組間不同性別者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表4、5。

表4 3組不同性別者GSK-3β蛋白水平結(jié)果比較

表5 3組不同性別者GSK-3β活性水平結(jié)果比較

注：與同性別健康對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

GSK-3β在細(xì)胞內(nèi)作為眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要調(diào)控酶之一，可影響多種細(xì)胞的生長及凋亡，其在體內(nèi)的作用各有利弊，過度激活或抑制都可能引起機(jī)體的病理改變[5]。Pearce等[6]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β過表達(dá)對小鼠整體葡萄糖耐量具有一定的影響。一個(gè)選擇性地在骨骼肌過度表達(dá)GSK-3β亞型的小鼠模型與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠比較，雄性GSK-3β轉(zhuǎn)基因小鼠糖原合成酶活性和糖原水平降低。口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)中，雄性GSK-3β轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出極其強(qiáng)烈的葡萄糖反應(yīng)及胰島素水平升高，提示整體水平的胰島素敏感性降低，并表現(xiàn)出血脂障礙。動物模型顯示GSK-3β高表達(dá)與胰島素敏感性降低具有相關(guān)性。Satish等[7]研究報(bào)道，GSK-3β是骨骼肌中葡萄糖合酶的主要調(diào)節(jié)基因，GSK-3β可一定程度抑制2型糖尿病患者骨骼肌及肝臟中胰島素抵抗作用。凌振芬等[8]研究證實(shí)，2型糖尿病患者外周血白細(xì)胞中GSK-3β的酶活性明顯高于健康者。楊莉莉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下足細(xì)胞GSK-3β表達(dá)量增多，足細(xì)胞單層屏障功能受損，可能是引起糖尿病腎病的重要因素之一。 綜上所述，大量的動物實(shí)驗(yàn)及人體指標(biāo)監(jiān)測都提示GSK-3β在機(jī)體中的異常表達(dá)與高血糖密切相關(guān)。

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者與健康對照者的GSK-3β基因相對表達(dá)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[9]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2型糖尿病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)量較健康對照組明顯增多(P<0.05)，但兩者的活性水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。將2型糖尿病患者分為血糖未控制組(實(shí)驗(yàn)1組)和血糖控制組(實(shí)驗(yàn)2組)，提示實(shí)驗(yàn)1組的GSK-3β活性水平比實(shí)驗(yàn)2組和健康對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)2組的GSK-3β活性水平與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)2組的GSK-3β蛋白水平比健康對照組升高(P<0.05)，而與實(shí)驗(yàn)1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同組別的性別者，男性GSK-3β活性水平相對增高，尤其以實(shí)驗(yàn)1組男性增高更甚，高于健康對照組男性(P<0.05)。

2型糖尿病患者GSK-3β基因并未發(fā)生結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，但在經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子之后，出現(xiàn)蛋白質(zhì)水平高表達(dá)。經(jīng)過藥物治療后的2型糖尿病患者，血糖得到有效控制者GSK-3β蛋白水平仍高表達(dá)，但活性水平明顯下降。說明2型糖尿病治療對GSK-3β在機(jī)體的影響，更多的是其活性抑制，而對蛋白影響并不明顯。提示同時(shí)檢測GSK-3β在人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的蛋白及活性水平有利于2型糖尿病的臨床診斷及病情發(fā)展的觀察。臨床用藥方面可考慮進(jìn)一步探索抑制GSK-3β活性或蛋白合成的藥物在2型糖尿病治療中的應(yīng)用。

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The protein expression and activity of glycogen synthase kinase 3β in the peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetic patients

TANJie1,WUJianhua2△,WANGJiangping2,ZOUJunqing2,MINGAnping2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Hubei430061,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan，Hubei430061,China)

Objective To investigate the clinical value of observing the differences of GSK-3β protein expression and activity level in the peripheral blood mononuclear cells between type 2 diabetes mellitus patients and healthy people.Methods Using ELISA to detect the GSK-3β protein expression and activity levels of people who contained 30 patients with type 2 diabetes whose blood glucose were not controlled (test group 1),30 cases of patients with type 2 diabetes whose blood glucose were controlled (test group 2) and 30 cases of healthy human and all the data were analyzed.Results The GSK-3β protein content of Type 2 diabetes mellitus group was higher than the control group(P<0.05),the activity level of GSK-3β in test group 1 was higher than the control group and test group(P<0.05).The GSK-3β protein content of test group 2 was higher than the control group(P<0.05).The male GSK-3β activity level in the test group 1 was higher than the men′s in the control group(P<0.05).Conclusion The GSK-3β protein content has a high expression in the type 2 diabetes mellitus patients.After drug treatment,the patients,who have controlled the blood glucose effectively,still showes high expression of the GSK-3β protein content,but the activity levels showes a significant decline.In male patients with type 2 diabetes blood sugar in the control group of GSK-3β showes significantly higher activity level.

type 2 diabetes mellitus; peripheral blood mononuclear cells; glycogen synthase kinase 3β

譚婕，女，主治醫(yī)師,主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.011

A

1673-4130(2016)20-2831-03

2016-04-06

2016-06-11)