阿力木江·買買提江 李 勇 施海明 姜曉斐

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紅景天對缺血心肌腎上腺髓質(zhì)素表達(dá)的靶向作用

阿力木江·買買提江 李 勇 施海明 姜曉斐

目的：探討紅景天對大鼠心肌梗死后血管新生過程中腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin, ADM)表達(dá)的調(diào)控作用。 方法：將8周齡雄性Wistar大鼠分為4組，正常對照組、假手術(shù)組、心肌梗死造模后生理鹽水對照組(生理鹽水組)及心肌梗死造模后紅景天干預(yù)組(紅景天組)。飼養(yǎng)1周后處死動(dòng)物，摘取心臟制作石蠟切片，采用CD31免疫組化染色進(jìn)行微血管標(biāo)記染色；處死動(dòng)物前留取血漿，采用ELISA法測定血漿ADM濃度；Western blot檢測不同組心肌組織ADM的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：與正常對照組、假手術(shù)組及生理鹽水組相比，紅景天組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度明顯升高；紅景天組(1.06±0.01)及生理鹽水組(0.52±0.09)的缺血心肌組織ADM蛋白表達(dá)水平較正常對照組及假手術(shù)組均明顯升高(P<0.05)，紅景天組較生理鹽水組ADM蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)；紅景天組[(32.28±5.13)ng/L]和生理鹽水組[(28.55±3.49) ng/L]血漿ADM水平較正常對照組及假手術(shù)組均明顯升高(P<0.05)，但紅景天組和生理鹽水組之間無明顯差異。 結(jié)論：心肌梗死后大鼠血漿ADM水平變化與心肌內(nèi)不同步，紅景天對ADM表達(dá)的上調(diào)作用主要在缺血心肌，具有一定的靶向性。

紅景天；腎上腺髓質(zhì)素；心肌梗死；血管新生

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)是指通過藥物、轉(zhuǎn)基因或其他干預(yù)手段，加快缺血心肌新生血管的形成[1]。體內(nèi)血管新生過程是由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、腎上腺髓質(zhì)素(ADM)等多種促血管新生因子調(diào)控的。

ADM是一種心血管活性多肽,具有擴(kuò)血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)效應(yīng)[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)ADM在心力衰竭[3]、心肌梗死[4]及肺動(dòng)脈高壓[5]等多種心血管疾病中具有明顯的保護(hù)作用，這與其改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、舒張血管、抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管新生等多種保護(hù)性機(jī)制相關(guān)[6-8]。

紅景天是生長于高寒低氧地帶的植物，其耐缺氧作用的機(jī)制一直受到關(guān)注。紅景天的藥理作用廣泛[9-10]，我們以往的研究證實(shí)紅景天具有促缺血心肌血管新生的作用[11-13]，本研究初步探討紅景天對缺血心肌ADM表達(dá)的靶向作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡雄性Wistar大鼠24只(由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為4組：正常對照組3只，不進(jìn)行任何干預(yù)；假手術(shù)組3只，開胸后僅在相應(yīng)手術(shù)部位空穿1針后關(guān)閉胸腔,前兩組動(dòng)物只進(jìn)行普通喂養(yǎng)；其余兩組為心肌梗死造模組，根據(jù)干預(yù)藥物分為生理鹽水組和紅景天組，每組9只。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎標(biāo)準(zhǔn)方法建立急性心肌梗死大鼠模型[14],造模前7 d開始藥物干預(yù)，每日清晨灌胃1次，每次2 mL干預(yù)藥物，至造模后7 d，經(jīng)股動(dòng)脈采血5 mL，留存血漿后處死大鼠，取出心臟進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)。

1.2 干預(yù)藥物制備

大花紅景天(上海雷允上大藥房)塊莖粉碎后水煎3次，藥汁過濾濃縮干燥后制成干粉(1 kg紅景天塊莖制成紅景天干粉211.59 g)，高效液相色譜-紫外檢測法測定每克紅景天干粉中含8.3 mg紅景天苷。18 g紅景天干粉溶解于300 mL蒸餾水中制備紅景天溶液。

1.3 組織化學(xué)檢測

大鼠心肌組織常規(guī)脫水石蠟包埋切片(厚度4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；CD31免疫組化染色(SP法)進(jìn)行微血管標(biāo)記染色?！?00視野下觀察微血管密度。

1.4 ELISA檢測血漿ADM濃度

大鼠處死前留取的血漿按照ADM酶聯(lián)免疫試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司)標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，450 nm波長測量吸光度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算血漿ADM濃度。

1.5 Western blot檢測心肌ADM表達(dá)

用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液抽提組織蛋白，BCA法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量蛋白濃度并稀釋配平。SDS-PAGE電泳法(10%分離膠、4%濃縮膠)分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，ADM抗體(1∶500,RD公司)、 β-actin(1∶2000，RD公司)抗體4℃過夜，二抗室溫孵育1 h后顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天促缺血心肌血管新生

大鼠心肌梗死造模7 d后對心臟組織切片行HE染色，與假手術(shù)組相比，紅景天組及生理鹽水組光鏡下可見梗死邊緣區(qū)心肌凝固性壞死，間質(zhì)水腫及中性粒細(xì)胞浸潤明顯，但紅景天組和生理鹽水組非梗死區(qū)鏡下表現(xiàn)與正常對照組和假手術(shù)組相似，均未見明顯異常，見圖1。

CD31免疫組化染色后紅景天與生理鹽水兩組梗死邊緣區(qū)與非梗死區(qū)相比，梗死邊緣區(qū)CD31染色陽性的棕褐色細(xì)胞(心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞)較多；與生理鹽水組相比，紅景天組梗死邊緣區(qū)棕褐色染色較密集，形成管腔較多；紅景天和生理鹽水組非梗死區(qū)與正常對照組及假手術(shù)組相似。見圖2。

注：A為紅景天組梗死邊緣區(qū)；B為生理鹽水組梗死邊緣區(qū)；C為假手術(shù)組；D為紅景天組非梗死區(qū)；E為生理鹽水組非梗死區(qū)；F為正常對照組圖1 各組大鼠心肌HE染色照片(×200)

注：A為紅景天組梗死邊緣區(qū)；B為生理鹽水組梗死邊緣區(qū)；C為假手術(shù)組；D為紅景天組非梗死區(qū)；E為生理鹽水組非梗死區(qū)；F為正常對照組圖2 各組大鼠心肌CD31免疫組化染色照片(×200)

2.2 紅景天促缺血心肌ADM蛋白表達(dá)

Western blot檢測心肌組織ADM蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天組和生理鹽水組ADM表達(dá)水平較正常對照組和假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)，其中紅景天組較生理鹽水組ADM表達(dá)水平又有明顯增加(P<0.05)，見表1。

2.3 紅景天對心肌缺血大鼠血漿ADM水平無明顯影響

表1 各組大鼠心肌ADM 蛋白表達(dá)水平

注：各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)符合正態(tài)分布。與生理鹽水組相比，(1)P<0.05；與假手術(shù)組相比，(2)P<0.05；與正常對照組相比，(3)P<0.05

采用ELISA法檢測大鼠血漿ADM濃度發(fā)現(xiàn)，紅景天組和生理鹽水組大鼠血漿ADM水平較正常對照組和假手術(shù)組均有升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但紅景天組與生理鹽水組之間血漿ADM水平無明顯差異，見表2。

表2 各組大鼠血漿ADM 水平/ng·L-1

注：各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)符合正態(tài)分布。與生理鹽水組相比，(1)P<0.05；與假手術(shù)組相比，(2)P<0.05；與正常對照組相比，(3)P<0.05

3 討論

ADM是1993年由Kitamura等[15]在嗜鉻細(xì)胞瘤中提取的一種具有強(qiáng)降壓和擴(kuò)血管作用的肽類物質(zhì)，屬于降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide ，CGRP)超家族成員。ADM廣泛分布于心血管、呼吸道、腎臟、內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)、腸道和免疫系統(tǒng)[16]，如此廣泛的分布提示ADM在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中作用的多樣性，循環(huán)中的ADM主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞。正常人循環(huán)中ADM水平很低，在發(fā)生心力衰竭、肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等多種疾病時(shí)，血漿ADM水平明顯升高[3-5]。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，以往研究提示在急性心肌缺血過程中，紅景天通過調(diào)節(jié)VEGF、FGF等血管新生相關(guān)因子的表達(dá)水平，促進(jìn)血管新生[13]。本研究通過CD31特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)一步證實(shí)紅景天有促缺血心肌血管新生作用，這一過程同時(shí)伴隨大鼠缺血心肌ADM蛋白表達(dá)的明顯升高。本研究還發(fā)現(xiàn)心肌梗死大鼠血漿ADM水平明顯高于假手術(shù)組，但與生理鹽水對照組相比，紅景天處理不影響血漿ADM水平，提示心肌缺血本身促進(jìn)循環(huán)ADM的產(chǎn)生，但紅景天對ADM的作用定位于缺血心肌本身而非全身系統(tǒng)性影響。鑒于ADM為促血管新生調(diào)控因子之一，本研究提示紅景天促缺血心肌血管新生的作用可能與靶向調(diào)控心肌局部ADM水平相關(guān)。

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(收稿：2016-04-01 修回：2016-06-25)

(本文編輯：丁媛媛)

The targeting effect of rhodiola on the expression of adrenomedullin in ischemic myocardium

ALIMUJIANGMaimaitijiang,LIYong,SHIHaiming,JIANGXiaofei.

DepartmentofCardiology,HuashanHospitalaffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China

Objective:To explore the regulative effect of rhodiola on the expression of adrenomedullin(ADM) during angiogenesis of rats after myocardial infarction. Methods:The eight-week-old Wistar rats were divided into the normal control group, the sham-operated group, the saline group and the rhodiola group. They were sacrificed after one week feeding. Their hearts were resected and embedded in paraffin to make sections. Microvessels were marked with CD31 immunohistochemical staining. Plasma concentration of ADM was tested by ELISA before sacrifice. The protein expression levels of ADM in myocardial tissue among different groups were observed and compared by western blot. Results:The rhodiola enhanced the rat's microvascular density in infarcted border zones after treatment, showing significant difference as compared with saline group, sham-operated group and normal control group. The protein expressions of ADM in ischemic myocardial tissue after rhodiola (1.06±0.10) and saline treatment (0.52±0.09) were significantly higher than the other two groups (P<0.05), while rhodiola further up-regulated the ADM expression than saline (P<0.05). Plasma concentrations of ADM in rhodiola group [(32.28±5.13) ng/L] and saline group [(28.55±3.49) ng/L] were higher than those in the other two groups (P<0.05), while no significant difference was observed between rhodiola group and saline group. Conclusion:The rhodiola can up-regulate ADM expression in ischemic myocardial tissue. The change in ADM plasma concentration doesn't synchronize with the altered ADM expression in myocardial tissue after myocardial infarction. The up-regulatory effect of rhodiola on ADM expression is mainly focused on the ischemic myocardial, showing a targeting characteristic.

Rhodiola； Adrenomedullin； Myocardial infarction； Angiogenesis

國家自然科學(xué)基金(81573710)

200040 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科

姜曉斐，Email：sule_jiang@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.05.010