張明國，安 燕，張 濤，彭 彰，王 潘，陳魯喜，武志英

（1.西昌三牧乳業(yè)有限公司，四川 西昌 615013；2.涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，四川 西昌 615042）

四川攀西地區(qū)奶牛乳房炎病原菌調(diào)查與敏感藥物篩選試驗

張明國1，安 燕1，張 濤2，彭 彰1，王 潘2，陳魯喜2，武志英1

（1.西昌三牧乳業(yè)有限公司，四川 西昌 615013；2.涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，四川 西昌 615042）

為了解四川攀西地區(qū)奶牛乳房炎病原菌和主要病原菌的耐藥性情況，采用常規(guī)方法對3個奶牛場92個牛奶樣品中的病原菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果分離到17種菌，共計86株，分離到的病原菌數(shù)量最多的依次是大腸桿菌23株、綠膿桿菌17株、葡萄球菌15株、鏈球菌7株、沙雷菌屬4株、弗勞氏枸櫞酸桿菌3株、沙門氏菌3株、陰溝腸桿菌復(fù)合菌3株、糞腸球菌2株、豬丹毒絲菌2株以及坐皮膚球菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、屎腸球菌、睪丸酮叢毛單胞菌、枯草芽孢桿菌、施氏假單胞桿菌、奇異變形桿菌各1株。采樣量為12頭、16頭、18頭奶牛的3個場，分別分離出14種、13種、16種乳房炎病原菌。同時，采用常規(guī)藥敏試驗方法對分離病原菌株數(shù)量最多的8種主要病原菌即大腸桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、沙雷菌、弗勞氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌復(fù)合菌進(jìn)行了常用抗生素敏感試驗，結(jié)果表明他們均存在不同程度的耐藥性。

攀西地區(qū)；奶牛乳房炎；病原菌；耐藥性

乳房炎（mastitis）是奶牛場最常見疾病之一，全世界約有2.2億頭奶牛，其中乳房炎的頭數(shù)陽性率48.2%～ 69.7%，乳區(qū)陽性率31.0%～51.2%［1］，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，每年高達(dá)約350億美元［2］。其中，美國30%～70%的奶牛至少有一個被感染的乳區(qū)，每年因乳房炎引起的直接損失超過20億美元［3］。在我國，奶牛乳房炎也是奶牛場最常見的疾?。?-7］，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失超過1.35億元［3］，尤其在南方地區(qū)，氣溫高且持續(xù)時間長，濕度大，環(huán)境中的病原菌大量繁殖，乳房炎的危害更為嚴(yán)重。

奶牛乳房炎與奶牛遺傳因素、環(huán)境條件、擠奶操作、擠奶機(jī)物理因素等有關(guān)，這些可引起奶牛乳房及乳腺組織損傷，進(jìn)一步感染病原菌而導(dǎo)致乳腺組織發(fā)炎。引起奶牛乳房炎的病原菌種類很多，幾乎所有病例均為多種病原菌混合感染，但同一種抗生素對不同病原菌的效果不同，在不同奶牛場，因同一種病原菌對同一種抗生素耐藥程度不同，其抗生素的效果也不盡相同，因此，許多研究人員分別對奶牛乳房炎病例的病原進(jìn)行調(diào)查，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行抗生素敏感試驗，篩選敏感藥物進(jìn)行防治［8-13］。

近年來，四川攀西地區(qū)乳業(yè)得到快速發(fā)展。但乳房炎也是制約攀西地區(qū)奶牛養(yǎng)殖的主要疾病。攀西地區(qū)與四川內(nèi)地比較，在氣溫、濕度、地貌等有較大差異，引起奶牛乳房炎的病原菌可能有一定差異，雖然有學(xué)者對攀西地區(qū)奶牛乳房炎進(jìn)行過調(diào)查［14］和防治［15］，但對其病原種類和耐藥性未見報告，為提高攀西地區(qū)奶牛乳房炎的防治效果，進(jìn)行了以下試驗。

1 材料與方法

1.1 樣品與采集

先后在西昌地區(qū)3個奶牛場分別采集12頭、16頭、18頭奶牛共計92份牛奶樣品。在每頭奶牛對角2個乳頭，清洗干凈后棄第一把擠出的牛奶，用滅菌試管采集第二把牛奶，蓋上棉塞子后迅速帶回實(shí)驗室備測。

1.2 主要病原分離鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基 采用TSB液體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂平板、牛心腦浸液培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉平板、卵黃瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.2 鑒別培養(yǎng) 將TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中的菌液分別劃線接種麥康凱培養(yǎng)基、S.S瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉平板以及鮮血瓊脂平板，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。同時將牛心腦浸液培養(yǎng)基中菌液接種于卵黃瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離純化 分別挑取麥康凱平板上的紅色、SS瓊脂平板上的無色且中心為黑色、甘露醇氯化鈉平板上金黃色且邊緣黃暈、卵黃瓊脂培養(yǎng)基上的圓形光滑周圍有乳白色渾濁圈或反光彩色光圈，以及鮮血瓊脂平板不同形態(tài)、大小、表面粗糙或光滑、是否溶血、有無色素與否等的單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)菌鑒定 將分離純化的不同菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色和生化反應(yīng)試驗，根據(jù)鏡檢的細(xì)菌形態(tài)和大小以及生化反應(yīng)試驗結(jié)果，并結(jié)合該菌株在不同培養(yǎng)基上的生長特征進(jìn)行鑒定。

1.3 藥物敏感性試驗

采用抗生素敏感試驗的常規(guī)方法，將主要病原菌培養(yǎng)液均勻涂抹在固體培養(yǎng)基上，在無菌條件下將抗生素紙片貼在涂好菌的平皿上，按照美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）頒布的藥敏試驗的規(guī)范操作［16］，即各紙片中心相距至少10mm以上，兩紙片中心相距至少30mm，避免這兩種紙片毗鄰，用鑷子加紙片并輕壓使之緊貼瓊脂表面，置37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h。取出培養(yǎng)皿后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，參考獸醫(yī)臨床常用的藥敏試驗判斷結(jié)果，抑菌圈直徑小于10mm判定為耐藥，抑菌圈直徑為10～15mm判定為中度敏感，抑菌圈直徑大于15mm判定為高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 乳房炎病原菌

共分離出奶牛乳房細(xì)菌種類17種，即大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、陰溝腸桿菌復(fù)合菌、鏈球菌、弗勞氏枸櫞酸桿菌、綠膿桿菌、沙雷菌、坐皮膚球菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、睪丸酮叢毛單胞菌、豬丹毒絲菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、糞腸球菌、施氏假單胞桿菌、屎腸球菌。

共分離到細(xì)菌86株，其中大腸桿菌23株、綠膿桿菌17株、葡萄球菌15株、鏈球菌7株、沙雷菌屬4株、弗勞氏枸櫞酸桿菌3株、沙門氏菌3株、陰溝腸桿菌復(fù)合菌3株、糞腸球菌2株、豬丹毒絲菌2株、坐皮膚球菌1株、產(chǎn)酸克雷伯氏菌1株、屎腸球菌1株、睪丸酮叢毛單胞菌1株、枯草芽孢桿菌1株、施氏假單胞桿菌1株、奇異變形桿菌1株。

2.2 3個奶牛場乳房炎病原菌比較

在采樣的3個奶牛場分別分離到病原菌數(shù)量14、13、16種（表1），結(jié)果表明，采樣量為18頭的奶牛場C乳房感染病原菌種類達(dá)16種，采樣量為12頭的奶牛場A乳房炎病原菌有14種，而采樣量為16頭的奶牛場B乳房炎病原菌有13種，其病原菌種類數(shù)量差異不大。

2.3 主要病原菌藥敏試驗結(jié)果

對分離病原菌株數(shù)量最多的8種即大腸桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、沙雷菌、弗勞氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌復(fù)合菌進(jìn)行藥物敏感試驗，結(jié)果如下。

2.3.1 大腸桿菌 敏感藥物有氨芐青霉素、頭孢氨芐；中度敏感藥物有阿莫西林、慶大霉素、先鋒霉素Ⅰ、先鋒霉素Ⅴ、頭孢替坦；耐藥藥物有慶大霉素、羥氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、氯氨芐青霉素、頭孢拉定、左氧氟沙星、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶。

2.3.2 綠膿桿菌 敏感藥物有環(huán)丙沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟、阿米卡星、左氧氟沙星；中度敏感藥物有慶大霉素、氨曲南、托普霉素、阿莫西林；耐藥藥物有氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、舒巴坦、氯頭孢菌素、先鋒霉素IV、先鋒霉素Ⅰ、先鋒霉素Ⅴ、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶、慶大霉素。

2.3.3 葡萄球菌 敏感藥物有四環(huán)素、利福平、替咖環(huán)素、慶大霉素、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶；中度敏感藥物有萬古霉素、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南；耐藥藥物有青霉素G、克林霉素、阿莫西林。

2.3.4 鏈球菌 敏感藥物有頭孢他啶、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素；中度敏感藥物有慶大霉素、氨曲南、托普霉素；耐藥藥物有舒巴坦、氯頭孢菌素、先鋒霉素Ⅰ、先鋒霉素Ⅴ、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶。

表1 3個奶牛場乳房炎病原菌分離情況

2.3.5 沙雷菌屬 敏感藥物有氨芐青霉素、先鋒霉素IV、亞胺培南、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶；中度敏感藥物有先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅱ、慶大霉素、慶大霉素、左氧氟沙星；耐藥藥物有頭孢替坦、頭孢曲松、托普霉素、厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟阿米卡星。

2.3.6 弗勞氏枸櫞酸桿菌 敏感藥物有頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星；中度敏感藥物有頭孢曲松、慶大霉素、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶；耐藥藥物有氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、氯氨芐青霉素、頭孢拉定、頭孢氨芐、先鋒霉素Ⅰ、頭孢替坦。

2.3.7 沙門氏菌 敏感藥物有氨芐青霉素、頭孢替坦、頭孢氨芐；中度敏感藥物有阿莫西林、先鋒霉素Ⅰ、先鋒霉素Ⅴ、頭孢拉定；耐藥藥物有慶大霉素、羥氨芐青霉素、呋喃妥因、環(huán)丙沙星、氯氨芐青霉素、左氧氟沙星、甲氧芐氨嘧啶。

2.3.8 陰溝腸桿菌復(fù)合菌 敏感藥物有氨芐西林、哌拉西林、先鋒霉素Ⅴ、亞胺硫霉素、呋喃妥因片、甲氧芐氨嘧啶；中度敏感藥物有氨芐西林、左氧氟沙星、慶大霉素；耐藥藥物有克林霉素、達(dá)福普汀、萬古霉素、四環(huán)素。

3 討論

四川攀西地區(qū)的自然氣候有別于川西平原和丘陵山區(qū)，太陽光更強(qiáng)，濕度相對較小，但奶牛乳房炎仍然是攀西地區(qū)奶牛的主要疾病，尤其在雨季，奶牛乳房炎發(fā)病率更高［14］。本次試驗共分離到17種病原菌，表明攀西地區(qū)奶牛乳房炎病例也呈多種病原菌混合感染，這與其他地方報告的奶牛乳房炎為多種病原菌感染一致［17-20］。在92個牛奶樣品中分離到86株病原菌。從采樣的3個奶牛場比較，分離到的病原種類分別為14、13、16種，僅相差3種，而采樣量最少的12頭奶牛比16頭奶牛分離到的病原種類還多1種，采樣量最多的18頭牛也比采樣12頭牛的病原菌多2種。因此，本試驗分離到的奶牛乳房炎病原菌基本代表了四川攀西地區(qū)奶牛乳房炎病原菌情況。

對92個牛奶樣品中分離最多的8種病原菌進(jìn)行藥物敏感試驗，結(jié)果均存在不同抗生素和不同程度的耐藥性，這與其他奶牛場主要病原菌耐藥性的情況基本一致［9-13，16-20］。這些結(jié)果表明，該3個奶牛場防治乳房炎病應(yīng)采用抗生素交替使用，同時，應(yīng)選擇其他增強(qiáng)奶牛免疫抵抗力的生物制劑［21-22］或其他制劑［23］，以減少攀西地區(qū)奶牛乳房炎防治中的抗生素依賴壓力。

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Investigation on Pathogenic Bacteria from Dairy Cows with Mastitis and Bolting of Sensitive D rugs

Zhang Mingguo1，An Yan1，Zhang Tao2，et al
（1.Xichang Sanmu Dairy Industry Co.Ltd.，Xichang 615000，Sichuan，China；2.Liangshan Institute of Animal&Veterinary Science，Xichang615032，Sichuan，China）

In order to understand pathogenic bacteria from dairy cows with mastitis and their drug tolerence in Panxi area of Sichuan，92 milk samples from 3 dairy cow farms were collected and the pathogenic bacteria were isolated and separated by conventional method.The results showed that there were 18 pathogenic bacteria and 86 strains，including23 Eschera coli strains，17 Pseudomonas aeruginosa strains，15 Staphylococcus strains，7 Streptococcus strains，4 Serratia strains，3 Citrbacter freundii strains，3 Salmonella strains，3 Enterobacter cloacae strains，2 Enterococcus faecalis strains，2 Erysipelothrix strains，1 Dermacoccus strain，1 Klebsiella oxytoca strain，1 Enterococcus faecium strain，1 Comamonastestosteroni strain，1 Bacillus subtilis strain，1 Pseudomonas stutzeri strain.The results of drug sensitivity test with the 8main pathogenic bacteria showed that Eschera coli，Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus，Streptococcus，Serratia，Citrbacter freundii，Salmonella，Enterobacter cloacae were tolerant to antibiotics to some extent.

Panxi area；dairy cow；mastitis，pathogenic bacteria；drug tolerence

S858.23

A

2095-3887（2016）04-0046-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.013

2016-04-26

四川省科技支撐計劃項目（14ZC2175）

張明國（1964-），男，畜牧師。