申炳俊, 金麗虹, 張佳佳, 劉榮娟, 劉占偉, 劉昱鑫, 柴 浩, 田 堅(jiān)*

(1. 長春理工大學(xué) 清潔能源技術(shù)研究所， 吉林 長春 130022; 2. 長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長春 130022)

?

對(duì)-香豆酸與人血清白蛋白相互作用的熒光和表面增強(qiáng)拉曼光譜研究

申炳俊1, 金麗虹2, 張佳佳2, 劉榮娟2, 劉占偉2, 劉昱鑫2, 柴 浩2, 田 堅(jiān)1*

(1. 長春理工大學(xué) 清潔能源技術(shù)研究所， 吉林 長春 130022; 2. 長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長春 130022)

在模擬生理?xiàng)l件下，應(yīng)用熒光光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜法對(duì)對(duì)-香豆酸(p-CA)與人血清白蛋白 (HSA) 的結(jié)合機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果表明，p-CA對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，并伴有非輻射能量轉(zhuǎn)移。熒光光譜顯示，在298，304，310 K下，p-CA與HSA的結(jié)合常數(shù)(KA)分別為3.41×104，2.09×104，1.38×104L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)近似為1。表面增強(qiáng)拉曼光譜研究揭示，p-CA的酚基與HSA有效結(jié)合。標(biāo)記競爭實(shí)驗(yàn)指出，p-CA在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)主要在SiteⅠ。反應(yīng)過程熱力學(xué)參數(shù)表明，二者間的作用主要為靜電引力，且根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論求得p-CA與HSA間的距離為 5.11 nm。同步熒光光譜顯示，p-CA的結(jié)合沒有導(dǎo)致HSA構(gòu)象發(fā)生明顯變化。

熒光光譜； 表面增強(qiáng)拉曼光譜； 對(duì)-香豆酸； 人血清白蛋白； 反應(yīng)機(jī)理

Investigation on The Interaction betweenp-Coumaric Acid and Human

1 引 言

人血清白蛋白(Haman serum albumin，HSA)是人血漿中含量最豐富的載體蛋白，擔(dān)負(fù)著藥物的貯存、運(yùn)輸?shù)裙δ?，常常作為研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用的模型蛋白[1]。藥物吸收后進(jìn)入血液循環(huán)，可與血清蛋白質(zhì)以非共價(jià)方式結(jié)合，其聚集狀態(tài)及在機(jī)體中的分布、代謝等生理過程都受到血清白蛋白的影響。同時(shí)，藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合也會(huì)影響蛋白的構(gòu)象和功能。因此，研究藥物分子與HSA的結(jié)合作用，有助于深入了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、代謝機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)及蛋白質(zhì)構(gòu)象，具有重要的意義。

對(duì)-香豆酸(p-Coumaric acid，p-CA)化學(xué)名稱為對(duì)-羥基肉桂酸，屬于酚酸類化合物，是白花蛇舌草、海金莎草、杜仲葉等中草藥的主要活性成分之一。p-CA具有抗腫瘤、抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗菌消炎和利膽等明顯的生物活性，亦對(duì)肝的誘變和氧化損傷具有保護(hù)作用[2-6]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用品和飼料等領(lǐng)域。近年來，對(duì)p-CA的提取、分離、分析、藥效和藥理的研究已有不少報(bào)道，但在分子水平研究p-CA與HSA的相互作用尚未見報(bào)道。

熒光光譜法是研究藥物與HSA相互作用的最有效方法之一[7-9]，該方法可對(duì)藥物分子在HSA上的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合力類型等非共價(jià)作用特性及藥物引起的HSA構(gòu)象、結(jié)構(gòu)變化等方面信息進(jìn)行研究。表面增強(qiáng)拉曼光譜法(Surface enhanced Raman scattering，SERS)對(duì)研究分子內(nèi)和分子間的相互作用非常敏感，可提供有關(guān)分子構(gòu)型和化學(xué)鍵變化方面的信息[10-12]。

本文利用熒光光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)研究了p-CA與HSA的相互作用信息及p-CA對(duì)HSA構(gòu)象的影響，為更好地了解p-CA藥理作用提供理論支持。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的儀器主要有QE65000拉曼光譜儀(美國海洋公司)、F-280熒光分光光度計(jì)(天津港東公司)、320 pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器公司)、DC-4006高精度恒溫水浴(上海菁海儀器公司)和QL-901振蕩器(江蘇其林貝爾儀器公司)等。

人血清白蛋白(美國Sigma公司)配成濃度為1.0×10-4mol/L 的儲(chǔ)備液。對(duì)-香豆酸對(duì)照品(成都普菲德公司)配成濃度為2.0×10-3mol/L 的儲(chǔ)備液，用時(shí)適當(dāng)稀釋。華法林(南通飛宇公司)、布洛芬(德國Dr. Ehrenstorfer公司)和洋地黃毒苷(德國Dr. Ehrenstorfer公司)3種對(duì)照品均配成濃度為1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液。上述儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱中保存。緩沖溶液是濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl(內(nèi)含0.1 mol/L的NaCl，pH=7.4)，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，其他試劑均為分析純。熒光值用“內(nèi)濾光效應(yīng)”公式[13]進(jìn)行校正：

(1)

Fcor和Fobs為p-CA-HSA校正后和測量的熒光強(qiáng)度，Aex和Aem為p-CA在激發(fā)和發(fā)射波長處的吸光度值。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 熒光光譜

熒光發(fā)射譜的測定：在5 mL比色管中依次加入40 μL HSA儲(chǔ)備液和一定量的1.0×10-4mol/Lp-CA溶液，用pH 7.4 Tris-HCl緩沖液定容，充分混合，于恒溫水浴中作用30 min。固定激發(fā)波長為280 nm，入射和出射狹縫均為5 nm，記錄熒光發(fā)射譜。

同步熒光測定：溶液配制同上，設(shè)置發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度為5 nm，固定波長差Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，掃描同步熒光光譜。

標(biāo)記競爭實(shí)驗(yàn)：固定HSA和位點(diǎn)標(biāo)記試劑的濃度為1.0×10-6mol/L，充分混合，于恒溫水浴中作用30 min，向標(biāo)記試劑-HSA體系中分別加入一定體積的p-CA溶液，混合均勻，繼續(xù)在該溫度水浴中反應(yīng)30 min，掃描熒光光譜，參數(shù)同前。

2.2.2 拉曼光譜

理論計(jì)算：利用密度泛函理論(DFT)，在B3LYP/6-311+ +(d,p)基組水平上優(yōu)化p-CA幾何結(jié)構(gòu)，獲得該分子的全部振動(dòng)頻率。頻率修正因子為0.961 3[14]，所有計(jì)算均采用Guassian 09程序完成。

NRS測定：將p-CA固體標(biāo)樣置于載玻片上，進(jìn)行NRS測試。激發(fā)光波長為785 nm，達(dá)到樣品表面功率為100 mW，光譜分析范圍為0～2 000 cm-1，分辨率為2 cm-1，積分時(shí)間為10 s，累積3 次。

SERS測定：參照經(jīng)典的Lee法[15]制備銀溶膠。將0.5 mLp-CA溶液加入到一定體積的HSA儲(chǔ)備液中，配制終濃度比分別為1∶0，1∶1，1∶3，1∶5的混合液，pH=7.4 條件下作用30 min進(jìn)行藥物與HSA識(shí)別；與0.5 mL銀溶膠溶液混合，作用30 min后進(jìn)行SERS測定。測試條件同NRS。

3 結(jié)果與討論

3.1p-CA對(duì)HSA的熒光猝滅作用及機(jī)理

圖1為p-CA對(duì)HSA的熒光猝滅光譜，激發(fā)波長為280 nm。可以看出，HSA在340 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰。隨著藥物濃度的不斷增加，HSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度發(fā)生有規(guī)律的猝滅，但峰位和峰形基本保持不變。這表明p-CA能夠猝滅CHSA=1.0×10-6mol/L； 1～7:Cp-CA=(0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0)×10-6mol/L； 8: Cp-CA=1.0×10-6mol/L。

圖1p-CA對(duì)HSA的熒光猝滅光譜(T=298 K)

Fig.1 Fluorescence quenching spectra ofp-CA on HSA (T=298 K)

HSA的熒光，二者間存在相互作用。在280 nm激發(fā)下，p-CA分子在340 nm處無熒光產(chǎn)生，但是在430 nm處產(chǎn)生強(qiáng)度很弱的熒光發(fā)射峰(見圖1中曲線8)，其熒光強(qiáng)度隨p-CA濃度增加逐漸下降，這進(jìn)一步揭示，p-CA與HSA間可能生成復(fù)合物。

猝滅數(shù)據(jù)按動(dòng)態(tài)Stern-Volmer方程處理[16]：

(2)

式中，F(xiàn)0、F分別為無、有p-CA時(shí)的熒光強(qiáng)度；τ0為分子熒光平均壽命，約為10-8s；Kq為猝滅速率常數(shù)；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；[Q]為p-CA平衡濃度。結(jié)果列于表1。由表1可知，KSV隨溫度升高而減小，Kq值均大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)(2×1012L/(mol·s))[17]，表明p-CA與HSA形成穩(wěn)定的非共價(jià)復(fù)合物，其猝滅過程為靜態(tài)猝滅。

3.2 p-CA與HSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

對(duì)于靜態(tài)猝滅過程可用公式[18]計(jì)算結(jié)合常數(shù)(KA)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]，

(3)

固定HSA濃度，改變p-CA的濃度，得到lg[(F0-F)/F] -lg[Q]曲線，擬合獲得方程、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見表1。由表可知，p-CA與HSA 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近于1，表明HSA與p-CA相互作用只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。KA值隨溫度升高而降低，說明溫度升高導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性降低，這進(jìn)一步證明體系的猝滅過程為靜態(tài)猝滅。結(jié)合常數(shù)KA值為104數(shù)量級(jí)，說明p-CA與HSA之間具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。

表1 p-CA與HSA作用的猝滅常數(shù)KSV、結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

3.3 p-CA與HSA結(jié)合位置

SystemK'A/(104L·mol-1)nRφ/%華法林3.170.480.9135-7.04布洛芬2.560.570.9233-24.9洋地黃毒苷2.410.590.9301-29.3

3.4 p-CA與HSA的作用力類型

氫鍵、疏水作用、范德華力和靜電引力等是小分子與蛋白質(zhì)間的主要結(jié)合力類型。由Van’t Hoff 定律[19]可計(jì)算得到反應(yīng)體系的熱力學(xué)參數(shù)：

(4)

(5)

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)ΔH可看作常數(shù)，p-CA與HSA體系的熱力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表3。由熱力學(xué)參數(shù)可判斷p-CA與HSA作用力類型[20]。ΔH<0，ΔS>0，表明p-CA與HSA之間的作用力主要為靜電引力，ΔG<0說明結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行。原因在于siteⅠ是一個(gè)正電荷殘基包圍的口袋，p-CA中含有酚基和羧基陰離子與siteⅠ空腔內(nèi)堿性氨基酸殘基間容易產(chǎn)生靜電作用力。

表3 p-CA與HSA作用的熱力學(xué)參數(shù)

3.5 p-CA與HSA的結(jié)合距離

根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論[16]有如下關(guān)系：

(6)

(7)

(8)

圖2為HSA熒光發(fā)射光譜與p-CA吸收光譜的重疊圖，結(jié)合公式(8)，將光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和，得到J=1.84×10-14(cm3·L)/mol。取向因子K2取熒光給體與受體隨機(jī)分布的平均值2/3，溶劑的折射率N取水和有機(jī)物的平均值1.336，無受體存在時(shí)能量供體的熒光量子產(chǎn)率Φ取0.118，計(jì)算得到R0=2.71 nm。由R0和實(shí)驗(yàn)測得的E=0.022，獲得能量給體與受體間的距離r=5.11 nm。r>R0，進(jìn)一步證明p-CA對(duì)HSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅[18]，與3.1節(jié)和3.2節(jié)結(jié)論一致。r<7 nm說明HSA與p-CA間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移[21]。

圖2 HSA的熒光發(fā)射譜(a)和p-CA的吸收光譜(b) (T=298 K)

Fig.2 Fluorescence emission spectrum of HSA(a) and the absorption spectrum ofp-CA(b) (T=298 K)

3.6 p-CA對(duì)HSA構(gòu)象的影響

對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜，Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm分別只顯示酪氨酸、色氨酸殘基的熒光光譜特性。圖3為p-CA-HSA體系的同步熒光光譜?？梢钥闯?，隨著p-CA濃度的增加，Δλ=15 nm(a)和Δλ=60 nm(b)的熒光強(qiáng)度均呈顯著下降趨勢，但最大熒光發(fā)射峰波長無顯著變化。即酪氨酸和色氨酸殘基周圍環(huán)境無明顯變化，這表明p-CA的作用沒有引起HSA構(gòu)象的變化。

3.7 p-CA與HSA分子間結(jié)合狀態(tài)

p-CA的理論拉曼光譜、NRS和SERS的比較研究是進(jìn)一步分析p-CA與HSA分子間結(jié)合狀態(tài)的前提和基礎(chǔ)。我們應(yīng)用B3LYP/6-311++(d,p)對(duì)p-CA進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計(jì)算，在結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)虛頻的存在，說明優(yōu)化得到的分子結(jié)構(gòu)式是穩(wěn)定的。優(yōu)化后的p-CA分子結(jié)構(gòu)如圖4所示。

CHSA=1.0×10-6mol/L； 1～7:Cp-CA=(0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0)×10-6mol/L。

圖3p-CA與HSA作用的同步熒光光譜(T=298 K)。(a) Δλ=15 nm；(b) Δλ=60 nm。

Fig.3 Synchronization fluorescence spectra ofp-CA and HSA(T=298 K). (a)Δλ=15 nm. (b)Δλ=60 nm.

3.7.1p-CA的理論拉曼光譜、NRS和SERS

圖5顯示的是p-CA理論拉曼光譜(曲線1)、固體粉末的NRS(曲線2)和其水溶液在銀溶膠中的SERS(曲線3)?？梢钥闯觯琾-CA的NRS和SERS峰位與理論計(jì)算拉曼光譜基本一致，主要基團(tuán)的拉曼峰都存在，只是稍有偏移或強(qiáng)度的變化。

表4 p-CA的實(shí)測拉曼特征峰與理論計(jì)算值及其歸屬

表4(續(xù))

aν:stretching;δ：in-plan bending;γ:out-of plane bending;σ：scissoring;ρ：wagging;ω：rocking;τ：torsion; as：asymmetric.

3.7.2p-CA與HSA作用的SERS

Fig.6 SERS of HSA andp-CA complexes in silver colloid with different concentration ratios

4 結(jié) 論

在模擬生理?xiàng)l件下，研究了不同濃度對(duì)-香豆酸(p-CA)與人血清白蛋白(HSA)作用的熒光光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜。闡明了p-CA對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，并伴隨有非輻射能量轉(zhuǎn)移，推斷p-CA分子以酚基通過靜電引力方式與HSA的亞域ⅡA的SiteⅠ進(jìn)行結(jié)合，兩者間的結(jié)合作用較強(qiáng)，其結(jié)合常數(shù)為104數(shù)量級(jí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，結(jié)合距離為5.11 nm。p-CA的加入沒有導(dǎo)致HSA構(gòu)象發(fā)生明顯變化。此外，p-CA與HSA作用前后，均以—COO-與銀納米顆粒表面進(jìn)行吸附，其吸附方式分別為垂直吸附和平行吸附。

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申炳俊(1977-)，男，吉林通化人，助理研究員，博士研究生，2007年于長春理工大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事光譜分析理論與應(yīng)用的研究。

E-mail: bjshen@cust.edu.cn田堅(jiān)(1956-)，男，吉林長春人，教授，博士生導(dǎo)師，1996年于東北大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事激光與物質(zhì)相互作用、能源科學(xué)技術(shù)與工程等的研究。

E-mail: tianjian@cust.edu.cn

Serum Albumin by Fluorescence and Surface Enhanced Raman Spectra

SHEN Bing-jun1, JIN Li-hong2, ZHANG Jia-jia2, LIU Rong-juan2, LIU Zhan-wei2, LIU Yu-xin2, CHAI Hao2, TIAN Jian1*

(1.LaboratoryofCleanEnergyTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China; 2.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

*CorrespondingAuthor,E-mail:tianjian@cust.edu.cn

Under simulated physiological conditions, the binding mechanism betweenp-Coumaric acid (p-CA) and human serum albumin (HSA) was investigated by fluorescence spectrum and surface enhanced Raman scattering (SERS). The results show that the effect betweenp-CA and HSA is a static fluorescence quenching with F?rster’s non-radioactive energy transformation. At 298, 304, 310 K, the binding constants (KA) betweenp-CA and HSA are 3.41×104, 2.09×104, 1.38×104L/mol, the binding site (n) value is approximate to 1. SERS reveals that the phenolic group ofp-CA combines with HSA. Thermodynamic data indicate that the interaction betweenp-CA and HSA is mainly electrostatic attraction. Marker competition experiments point out that the primary binding site forp-CA is located at site Ⅰ in HSA. According to F?rster energy transfer theory, the binding distance betweenp-CA and HSA is 5.11 nm. Synchronous fluorescence spectra show that the conformation of HSA does not changed apparently with the addition ofp-CA.

fluorescence spectrum; surface enhanced Raman scattering;p-Coumaric acid; human serum albumin; reaction mechanism

1000-7032(2016)10-1259-08

2016-04-18；

2016-08-04

國家自然科學(xué)基金(21153003)； 吉林省教育廳項(xiàng)目(201574)； 長春理工大學(xué)博士后基金(2014年)資助項(xiàng)目

O657.3

A

10.3788/fgxb20163710.1259