馬　申，白晶晶，劉月球，高鳳玉，范　博，李素婷

（1.承德醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)本科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院2014級臨床醫(yī)學(xué)本科，3.指導(dǎo)教師）

學(xué)生園地

益心酮對急性酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

馬申1，白晶晶1，劉月球1，高鳳玉1，范博2，李素婷3

（1.承德醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)本科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院2014級臨床醫(yī)學(xué)本科，3.指導(dǎo)教師）

益心酮；Bcl-2；Bax；酒精性肝損傷

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及肝硬化。近年來研究表明，酒精作為肝細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，誘發(fā)肝細(xì)胞異常凋亡在ALD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1］。在眾多凋亡相關(guān)基因中，Bcl-2家族與肝細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。Bcl-2和Bax分別作為Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡的代表基因，在肝細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控中起中心作用［2］。本研究建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，觀察了益心酮對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，以探討益心酮對酒精性肝損傷保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：昆明種小鼠，雄性，清潔級，體重22g±2g，石家莊實(shí)驗(yàn)動物管理中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器：益心酮片（山楂葉總黃酮制劑，每片含山楂葉總黃酮32mg），購于山西振東泰盛制藥有限公司；56%紅星二鍋頭白酒，北京紅星釀酒廠生產(chǎn)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，β-actin、Bcl-2、Bax兔抗小鼠多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Olympus顯微鏡，日本Olympus株式會社；組織切片機(jī)，德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模與給藥［3］：雄性昆明種小鼠60只隨機(jī)分為正常組、模型組、益心酮低（40mg/kg）、高（80mg/kg）劑量組，每組15只。正常組每天給予蒸餾水0.4ml灌胃，模型組和益心酮組按8ml/kg/次灌胃給予56°二鍋頭白酒，2次/d，連續(xù)10d天造模結(jié)束。自造模第1天起，益心酮組在每日13：00灌胃給藥一次，正常組和模型組同時(shí)灌服等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠自由飲水、進(jìn)食。最后一次灌胃結(jié)束后，禁食不禁水16h，斷頭處死小鼠，取出肝臟。部分肝臟-80℃凍存待測，部分肝臟置于10%甲醛溶液固定。

1.2.2 檢測肝細(xì)胞凋亡：肝組織10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡情況。以肝細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色染色為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每例標(biāo)本選取5個(gè)高倍視野（400倍）觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞核數(shù)占該視野肝細(xì)胞核總數(shù)的百分比，取均值作為凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.2.3 Western Blotting法檢測肝臟Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)：取新鮮肝組織100mg提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取50 μ g肝組織蛋白行8% SDS-聚丙烯凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，室溫下一抗（1：200稀釋）孵育2h，羊抗兔IgG/HRP二抗（1：3000稀釋）室溫孵育1.5h，按照ECL免疫檢測試劑盒進(jìn)行曝光、顯影、洗片。以β-actin（1：200稀釋）作為內(nèi)參照，膠片掃描后獲得圖像。采用Quantity One 4.4分析軟件測定條帶灰度值，以Bcl-2、Bax蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益心酮對酒精引起小鼠肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

正常組小鼠肝細(xì)胞無或偶見凋亡，模型組小鼠肝組織中可見大量棕黃色、棕褐色凋亡細(xì)胞核，散在分布于肝小葉內(nèi)。與正常組比較，模型組小鼠肝細(xì)胞AI值明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，益心酮低劑量組、高劑量組肝細(xì)胞AI值明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。見附表。

2.2 益心酮對肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織Bcl-2表達(dá)明顯降低、Bax表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；給予益心酮灌胃后，小鼠肝組織Bcl-2表達(dá)明顯升高、Bax表達(dá)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。見附表：

附表 各組小鼠肝細(xì)胞AI值和肝組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況（±s，n=15）

附表 各組小鼠肝細(xì)胞AI值和肝組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況（±s，n=15）

與正常組比較：*P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01，##P＜0.05

組別AI（%）Bcl-2Bax正常組2.92±0.881.28±0.081.08±0.11模型組11.41±1.13*0.94±0.11*3.26±0.08*益心酮低劑量組9.78±2.43##1.47±0.14##1.82±0.06##益心酮高劑量組7.96±1.84#1.68±0.07#1.26±0.12#

3 討論

凋亡（apoptosis）是細(xì)胞在一定的生理或病理信號刺激下遵循自身程序，由基因控制的主動死亡行為。生物體通過凋亡機(jī)制完成對衰老細(xì)胞和畸形細(xì)胞的清除，但過度凋亡則會引起組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致功能障礙。近年來研究表明，病毒感染、毒性物質(zhì)、酒精等均可誘發(fā)肝細(xì)胞異常凋亡，引起各種急慢性肝損傷。酒精作為肝細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在ALD的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用［4］。

肝細(xì)胞凋亡機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為線粒體凋亡途徑最為重要。Bcl-2基因家族作為線粒體凋亡途徑中最有效的調(diào)控執(zhí)行者，與肝細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切［5］。Bcl-2是凋亡抑制基因，它編碼的蛋白位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，其抗凋亡作用的機(jī)制是抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體的通透性、防止細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，使凋亡效應(yīng)蛋白酶鏈不能激活，從而阻止細(xì)胞凋亡。Bax是Bcl-2家族中目前研究最廣泛的促凋亡基因，正常細(xì)胞中Bax定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)受到損傷或刺激后，激活的Bax結(jié)合在線粒體膜上，建立線粒體膜通道，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-2與Bax表達(dá)水平的平衡結(jié)果決定了凋亡信號刺激后細(xì)胞的存活或凋亡。一切干預(yù)細(xì)胞凋亡的因素都可最終歸結(jié)為對Bcl-2、Bax的改變，發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的作用［6］。

本研究顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，表明酒精介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肝損傷的主要原因；給予益心酮干預(yù)后，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，表明益心酮可通過抑制肝細(xì)胞凋亡起到保肝作用。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織Bcl-2表達(dá)明顯降低、Bax表達(dá)明顯增高，給予益心酮干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)明顯升高、Bax表達(dá)明顯降低，表明益心酮可通過上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用，這可能是益心酮對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

［1］朱傳龍，高人燾，李宜.凋亡及其調(diào)控基因Bcl-2家族在肝臟損傷中的作用［J］.實(shí)用肝臟雜志，2008，11（3）：206-209.

［2］靳雅玲，歐士鈺.Bcl-2、Bax與肝纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2013，20（1）：124-126.

［3］趙敏，池莉平，王鳳巖，等.小鼠急性酒精性肝損傷模型的建立及應(yīng)用［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，31（1）：14-17.

［4］安紅姬，金武丕.乙醇誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2007，28（10）：1155-1157.

［5］郭晨，李丹，林納，等.表達(dá)HBVX基因的小鼠模型的建立及對肝細(xì)胞凋亡因子的影響［J］.世界華人消化雜志，2011，19（12）：1225-1230.

［6］朱玉山，盧鐵元，王蕊，等.Bcl-2家族蛋白調(diào)控線粒體膜通透性和細(xì)胞色素C釋放的新機(jī)制［J］.生命科學(xué)，2011，23（11）：1076-1080.

（學(xué)生園地欄目編輯：張 健）

R944.4

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1004-6879（2016）02-0170-03

（2016-01-05）