安琦，徐丹丹，馮煒健，殷博

固體型微生物肥料中有效活菌洗脫條件的優(yōu)化

安琦1，2，徐丹丹3，馮煒健3，殷博1，2

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150010；3.哈爾濱學(xué)院，哈爾濱150000）

為減弱固體型微生物肥料中細(xì)菌與載體的吸附作用，提高菌體的洗脫效率，以巨大芽孢桿菌為供試菌，褐煤為載體，研究不同溫度、洗脫時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度對(duì)菌體洗脫效率的影響，優(yōu)化洗脫條件。結(jié)果顯示：巨大芽孢桿菌的最佳洗脫條件為轉(zhuǎn)速220 rpm、pH 7.6、離子濃度20 mM。

固體型微生物肥料；洗脫；優(yōu)化

與其他劑型微生物肥料相比，固體型微生物肥料具有易儲(chǔ)存和運(yùn)輸、施用方法簡(jiǎn)單及節(jié)約勞動(dòng)成本等優(yōu)點(diǎn)，受到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的青睞。有效活菌的數(shù)量是評(píng)價(jià)微生物肥料質(zhì)量的關(guān)鍵因素。目前，測(cè)定微生物肥料中有效活菌數(shù)的方法依然采用平板計(jì)數(shù)法。但在實(shí)際工作中，對(duì)固體樣品的檢測(cè)一直存在菌體洗脫率效低的問題，不能準(zhǔn)確反映固體樣品中真實(shí)有效活菌數(shù)量。由于微生物菌體與載體之間的吸附作用，樣品中的菌體在洗脫階段未能被完全洗脫。因此，打破微生物與載體間的吸附作用，提高菌體洗脫率是目前急需解決的問題［1，2］。

本研究以微環(huán)境下顆粒間吸附作用原理為基礎(chǔ)理論，重點(diǎn)研究代表性微生物菌體與生物有機(jī)肥主要載體之間的吸附作用及打破這種吸附的技術(shù)方法，提高菌體洗脫率，為固體型微生物肥料的廣泛應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），黑龍江省科學(xué)院微生物研究所保存。

1.2 載體

草炭來自雞西，有機(jī)質(zhì)約50%，腐殖酸含量36.1%。褐煤來自雞西，腐殖酸含量43.5%。雞糞來自正大養(yǎng)雞場(chǎng)，已腐熟。

1.3 培養(yǎng)基及緩沖液

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，1 000mLH2O，pH7.0。

磷酸鹽緩沖液（pH5.8）：0.2 mol/L NaH2PO48 mL，0.3 mol/L NaH2PO492 mL。

磷酸鹽緩沖液（pH6.4）：0.2 mol/L NaH2PO426.5 mL，0.3 mol/LNaH2PO473.5 mL。

磷酸鹽緩沖液（pH7.2）：0.2 mol/L NaH2PO472 mL，0.3 mol/LNaH2PO428 mL。

磷酸鹽緩沖液（pH7.6）：0.2 mol/LNaH2PO487 mL，0.3 mol/LNaH2PO413 mL。

磷酸鹽緩沖液（pH8.0）：0.2mol/L NaH2PO494.7mL，0.3 mol/LNaH2PO45.3mL。

2 方法

2.1 菌液的制備

活化Bacillus megaterium的保藏菌株，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100mL，30℃、120r/min培養(yǎng)48h后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 載體的處理

將草炭、褐煤和雞糞3種載體的pH調(diào)至7.0，高壓121℃蒸汽滅菌lh，檢查無(wú)菌后備用。

2.3 吸附試驗(yàn)

Bacillus megaterium的接種菌數(shù)為3.4×108cfu/g，均勻混合到經(jīng)高壓蒸汽滅菌的草炭、褐煤和雞糞3種載體中，用無(wú)菌水調(diào)水分30%～35%，密封室溫放置備用。

2.4 菌體洗脫單因素試驗(yàn)

樣品中有效活菌數(shù)的測(cè)定方法采用稀釋平板法，具體操作參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 20287-2006。稱取固體樣品10g，加入帶玻璃珠的盛有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，通常靜置20min，180rpm震蕩30min后，測(cè)定3種固體肥料樣品的有效活菌數(shù)。選取5個(gè)影響菌體洗脫效果的主要因素，包括溫度、洗脫時(shí)間、洗脫液pH值、轉(zhuǎn)速、離子濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。研究不同溫度對(duì)菌體洗脫的影響，分別于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下檢測(cè)樣品中有效活菌數(shù)量；研究不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌體洗脫的影響，分別于140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm震蕩后檢測(cè)樣品中有效活菌數(shù)量；研究不同pH對(duì)菌體洗脫的影響，用不同pH（pH 5.8、6.4、7.2、7.6、8.0）的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行菌體的洗脫；研究離子強(qiáng)度對(duì)菌體洗脫的影響，在洗脫液中分別加入10 mL不同離子強(qiáng)度的NaCl溶液（0 mM、10 mM、20 mM、40 mM、100 mM）。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌體洗脫條件

從單因素中選取對(duì)洗脫菌體密度影響較大的幾個(gè)因素，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同載體對(duì)供試菌的釋放效果

草炭、褐煤和雞糞3種載體對(duì)Bacillus megaterium的釋放能力有所不同。結(jié)果顯示，草炭和雞糞對(duì)供試菌的釋放顯著高于褐煤。因此選用褐煤作為載體進(jìn)行洗脫優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 不同載體對(duì)供試菌釋放效果Tab.1Separation effect of different carriers on bacteria

3.2 不同洗脫條件對(duì)菌體數(shù)量的影響

3.2.1溫度對(duì)菌體洗脫的影響

如圖1所示，隨溫度的升高，洗脫的菌體數(shù)量逐漸增多，40℃時(shí)，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)最高可達(dá)2.10×108cfu/g。

圖1 溫度對(duì)菌體洗脫的影響Fig.1Effect of temperature on bacteria elution

3.2.2時(shí)間對(duì)菌體洗脫的影響

選用不同時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，如圖2所示，供試菌的洗脫數(shù)量隨時(shí)間的增加逐漸增加，洗脫30min后變化趨于平緩。

圖2 時(shí)間對(duì)菌體洗脫的影響Fig.2Effect of time on bacteria elution

3.2.3轉(zhuǎn)速對(duì)菌體洗脫的影響

如圖3所示，轉(zhuǎn)速在140～200rpm，隨轉(zhuǎn)速增加，供試菌洗脫菌體數(shù)量呈上升趨勢(shì)，200rpm時(shí)菌體洗脫數(shù)量可達(dá)到最高。

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)菌體洗脫的影響Fig.3Effect of rotate speed on bacteria elution

3.2.4pH值對(duì)菌體洗脫的影響

如圖4所示，在一定范圍內(nèi)，菌體的洗脫數(shù)隨著pH值升高而增多，當(dāng)pH 7.6時(shí)，Bacillus megaterium的洗脫數(shù)量最高可達(dá)2.28×108cfu/g。

圖4 pH對(duì)菌體洗脫的影響Fig.4Effect of pH on bacteria elution

3.2.5離子強(qiáng)度對(duì)菌體洗脫的影響

由圖5所示，載體對(duì)供試菌的吸附受溶液中離子強(qiáng)度的影響。隨Na+濃度增加，解吸數(shù)逐漸降低，Bacillus megaterium的解吸數(shù)量最高可達(dá)2.28×108cfu/g。

圖5 離子濃度對(duì)菌體洗脫的影響Fig.5Effect of ionic concentration on bacteria elution

3.3 B.megaterium洗脫條件的正交優(yōu)化

表2 L9（34）正交設(shè)計(jì)編碼值及水平Tab.2L9（34）Code value and level of orthogonal design

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，溫度40℃、洗脫時(shí)間40 min時(shí)取得較為理想的洗脫效果，隨著溫度升高和洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，洗脫的菌體數(shù)量基本保持穩(wěn)定。進(jìn)一步對(duì)其他因素即轉(zhuǎn)速、pH值、離子濃度進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，采用L9（34）正交表，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。通過極差分析RC＞RA＞RB，說明影響B(tài).megaterium洗脫條件的主要因素依次為離子濃度＞轉(zhuǎn)速＞pH值，其中鈉離子濃度對(duì)活菌洗脫的影響最大。通過正交試驗(yàn)分析最適洗脫條件組合為A3B2C2即轉(zhuǎn)速為220 rpm、pH值7.6、離子濃度20 mM。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，洗脫活菌數(shù)達(dá)到2.31×108cfu/g，顯著高于其他正交試驗(yàn)組。

表3 B.megaterium洗脫條件正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3Orthogonal experiment result of elution condition of B. megaterium

4 討論

載體與細(xì)菌的吸附存在著復(fù)雜的作用方式與過程，是由分子間力、靜電力、疏水作用力、氫鍵和空間位阻效應(yīng)等多種作用因素共同影響的物理化學(xué)過程，其中靜電力、疏水作用力起著主導(dǎo)作用。依據(jù)吸附理論，菌體在載體上的吸附是可逆的，在總吸附自由能為正值時(shí)，會(huì)發(fā)生解吸。研究發(fā)現(xiàn)，土壤黏粒與微生物菌體之間的吸附作用，菌體在黏粒表面的吸附是熱力學(xué)自發(fā)過程［3，4］。因此，微生物和載體的表面性質(zhì)如表面電荷、疏水性及所處的環(huán)境條件如pH、電解質(zhì)濃度、溫度等，都影響著吸附過程。本研究中發(fā)現(xiàn)，離子強(qiáng)度對(duì)巨大芽孢桿菌具有顯著的影響是影響其洗脫的關(guān)鍵因素。當(dāng)體系pH從5.0上升到8.0，載體對(duì)細(xì)菌的吸附量是一個(gè)降低的過程，變化明顯，推斷其與靜電斥力有關(guān)。

［1］李元芳.有效活菌數(shù)的測(cè)定方法、允許差與判定［J］.土壤肥料，1997，（04）：43-45.

［2］蔣代華，黃巧云，卡蔡鵬，等.粘粒礦物對(duì)細(xì)菌吸附的測(cè)定方法［J］.土壤學(xué)報(bào)，2007，44（4）：656-662.

［3］周學(xué)永，陳守文，吳新世，等.蘇云金芽胞桿菌原毒素在蒙脫石上的吸附特性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：992-996.

［4］榮興民，黃巧云，陳雯莉，等.土壤礦物與微生物相互作用的機(jī)理及其環(huán)境效應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28（1）：376-387.

Optimization of elution conditions of living bacteria in solid microbial fertilizer

ANQi1，2，XUDan-dan3，F(xiàn)ENGWei-jian3，YINBo1，2
（1.Institute ofMicrobiology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150010，China；2.Institute ofAdvanced

Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；3.Harbin University，Harbin 150000，China）Abstract:The study aimed to weaken the adsorption between carrier and bacteria in solid microbial fertilizer and improve the elution efficiency of bacteria.Bacillus megateriumwas used as the target bacteria.Brown coal was used as the carrier. We researched on the bacteria elution efficiency via using different temperature，elution time，speed，pH and ionic concentration and ultimately optimize the elution conditions.The results revealed that optimal elution condition forBacillus megateriumwas the rotate speed of 220 rpm，pH7.6 and ionic concentration of 20mM.

Solid microbial fertilizer；Elution；Optimization

TQ446

A

1674-8646（2016）13-0001-03

2016-04-02

黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金

安琦（1988-），女，黑龍江齊齊哈爾人，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用研究。

殷博（1983-），男，黑龍江齊齊哈爾人，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用研究，e-mail：xinyu4026@163.com。