賈變桃，洪珊珊，張雨超，曹永偉

(山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801)

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阿維菌素對半閉彎尾姬蜂保護酶系和解毒酶系的影響

賈變桃，洪珊珊，張雨超，曹永偉

(山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801)

為明確阿維菌素對半閉彎尾姬蜂保護酶系和解毒酶系的影響，采用試管藥膜法以阿維菌素亞致死濃度(LC10和LC25)處理半閉彎尾姬蜂成蟲，分別于處理后1、12、24和48 h測定其體內(nèi)保護酶和解毒酶活性變化。結果表明，阿維菌素亞致死濃度處理后，隨著時間的延長，對寄生蜂體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性總體表現(xiàn)為誘導作用；對過氧化氫酶(CAT)活性表現(xiàn)為先抑制后誘導作用；對酯酶(EST)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和多功能氧化酶(MFO)具有顯著的抑制作用。研究結果為深入了解半閉彎尾姬蜂對阿維菌素的防御機理提供了一定的理論基礎。

阿維菌素；半閉彎尾姬蜂；保護酶；解毒酶

小菜蛾 Plutella xylostellaL.是一種重要的蔬菜害蟲，其幼蟲以十字花科蔬菜為食(牟芳等，2015)。在蔬菜生產(chǎn)中，小菜蛾的治理主要以化學防治為主，然而，由于殺蟲劑的大量使用，使小菜蛾對多種藥劑產(chǎn)生了抗藥性(Guoet al., 2013)，農(nóng)藥的有效性大大降低。半閉彎尾姬蜂 Diadegma semiclausumHellen(Hym.Icheneumonidae) 是小菜蛾幼蟲期的一種主要寄生蜂。該蜂起源于歐洲，被許多國家和地區(qū)引進用于小菜蛾的防治(TalerkarandShelton, 1993; 陳宗麒等，2003)，其控害作用十分有效。現(xiàn)已證明，這一寄生蜂在我國北方地區(qū)廣泛分布(劉樹生等，2004)。利用天敵進行生物防治，可降低化學殺蟲劑的使用量，延緩小菜蛾的抗藥性。然而，殺蟲劑的使用會降低生物防治的效果。因此，了解殺蟲劑對天敵的影響，協(xié)調化學防治和生物防治的關系，是制定小菜蛾綜合治理措施的關鍵。

阿維菌素(abamectin)是土壤鏈霉菌的天然發(fā)酵產(chǎn)物，作用于昆蟲神經(jīng)元突觸或神經(jīng)肌肉突觸的γ-氨基丁酸(GABA)門控氯離子通道和谷氨酸鹽門控氯離子通道，具有高效、廣譜、低殘留等特點，是當前防治小菜蛾等害蟲害螨的當家農(nóng)藥產(chǎn)品(劉開林等，2007)。盡管已有研究報道了阿維菌素對半閉彎尾姬蜂的毒力及安全性(繆森等，2000；吳國星等，2008；尹艷瓊等，2010；洪珊珊等，2015；賈變桃等，2015)，但關于阿維菌素對半閉彎尾姬蜂保護酶和解毒酶活性的影響還未見報道。與害蟲一樣，半閉彎尾姬蜂體內(nèi)存在的保護酶系和解毒酶系在殺蟲劑代謝和寄生蜂抗(耐)藥性等方面起著非常重要的作用，通過研究其活性變化，可以為深入了解半閉彎尾姬蜂對阿維菌素的防御機理，協(xié)調小菜蛾的生物防治和化學防治等提供理論依據(jù)。因此，作者研究了阿維菌素亞致死濃度對半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)保護酶系和解毒酶系活性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試昆蟲：半閉彎尾姬蜂于2013年4月采集于山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站未施藥的甘藍田，以室內(nèi)未接觸藥劑飼養(yǎng)的小菜蛾3齡幼蟲供其寄生，飼養(yǎng)條件為溫度25℃±2℃，相對濕度約70%，光周期14L ∶10D。

供試藥劑：1.8%阿維菌素EC(愛諾蟲清，華北制藥集團愛諾有限公司)。

生化試劑：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)試劑盒，購自南京建成生物研究所；苯硫脲(phenlthiourea，PTU)，上海藍季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、牛血清蛋白(bovine albumin，BSA)，美國Amresco公司生產(chǎn)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate，SDS)等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：Sorvall ST16R臺式冷凍離心機、Thermo Scientific酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific；MGC-300光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲的生物測定

采用試管藥膜法(洪珊珊等，2015)進行測定。

1.2.2 半閉彎尾姬蜂保護酶活性測定

酶液制備：根據(jù)毒力測定結果以阿維菌素LC10和LC25作為亞致死濃度，以含0.02%的Triton X-100的清水作對照，共3個處理。寄生蜂成蜂的處理方法同1.2.1。分別于處理后1、12、24和48 h取存活幼蟲凍存于-20℃冰箱備用。取處理后的寄生蜂成蟲40頭，置于預冷的3 mL玻璃勻漿器中，加入1.5 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液，冰浴研磨，將提取液轉入2 mL離心管中，于4℃、12000 rpm，冷凍離心20 min，將上清液稀釋2倍作為酶活性測定液，重復3次。

SOD、POD和CAT活性測定方法參照試劑盒說明書進行。SOD活性單位定義為每毫克組織蛋白在1 mL反應液中抑制率為50%時所需的酶量為一個酶活力單位(U)。POD活性單位定義為每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量為一個酶活力單位(U)。CAT活性單位定義為1 mg組織蛋白每秒分解1 μmol H2O2酶量為一個活力單位(U)。

1.2.3 半閉彎尾姬蜂解毒酶活性測定

酯酶(esterase，EST)活性測定：取不同處理半閉彎尾姬蜂成蟲40頭置于3 mL玻璃勻漿器中，加入預冷的1.5 mL 0.05 mol/L pH7.5磷酸緩沖液，冰浴研磨，將提取液轉入2 mL離心管中，于4℃、12000 rpm，冷凍離心20 min，將上清液稀釋2倍即為酶活性測定液，重復3次。

酯酶活性測定參照Hama and Hosoda(1983)的方法：在試管中加入5 mL 6×10-4mol/L α-乙酸萘酯，0.1 mL酶液，充分混勻，30℃恒溫水浴反應30 min后，加入1 mL顯色劑(1%固蘭RR鹽和5% SDS以2 ∶5(v/v)臨用前混合而成)。穩(wěn)定30 min后，在酶標儀上測定波長為600 nm處OD值。由α-萘酚標準曲線求出生成α-萘酚的量(mmol/L)。測定酶液中蛋白質含量，計算酯酶活性，單位為(μmol/mg pro·30 min)。

GST活性測定：酶液制備方法同酯酶。酶活性的測定參照試劑盒說明書進行。GST活性單位定義為每毫克蛋白在37℃反應1 min使反應體系中的GSH降低1 μmol/L為一個活力單位(U)。

多功能氧化酶(mixed function oxidase，MFO)O-脫甲基活性測定：參考謝苗等(2011)方法，并稍有改動，取20頭半閉彎尾姬蜂成蟲，置于3 mL 勻漿器中，加入預冷的0.1 mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含有1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF和10%甘油)1.5 mL，冰浴上充分勻漿，將勻漿液轉入 2 mL 離心管中，于4℃、10000 rpm，冷凍離心20 min，取上清液在15000 rpm、4℃下再離心20 min，所得上清液即為酶活性測定液，重復3次。

以對硝基苯甲醚為底物，在MFO的作用下生成對硝基苯酚鈉，在405 nm處測定其吸光值。反應體系：在試管中加入酶液0.1 mL，pH7.8磷酸緩沖液1.7 mL，4 mmol/L對硝基苯甲醚0.2 mL，0.5 mmol/L NADPH 1 mL。將反應液充分混勻后置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)30 min，加入1 mL 1 mol/L HCl終止反應。加入5 mL氯仿萃取10 min，取氯仿萃取層溶液(下層)3.5 mL于另一試管，加入3.5 mL濃度為0.5 mol/L NaOH溶液萃取10 min，取上層溶液加入96孔酶標板，于酶標儀上測定光密度值。根據(jù)光密度值從對硝基苯酚標準曲線上求出對硝基苯酚生成量(nmol/mL)。測定酶液中蛋白含量，計算MFO活性，單位為(nmol/mg pro·30 min)。

1.2.4 蛋白質含量測定

以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線。蛋白含量測定參照Bradford(1976)考馬斯亮藍法：取1支具塞試管，加入0.1 mL酶液，0.9 mL蒸餾水，5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2 min后，在酶標儀595 nm波長下測定吸光度值。根據(jù)上述標準曲線求出對應的蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

生物測定結果用Polo Plus 1.0軟件計算毒力回歸方程的斜率±標準誤、LC10、LC25及其95%置信限。不同處理酶活性數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行分析比較。

2 結果與分析

2.1 阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲的毒力

阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲LC10、LC25和LC50值及其95%置信限分別為1.330(0.361-2.315)、2.715(1.229-4.036)和6.003(4.039-8.896)mg/L，其LC50值與吳國星等(2008)測定的LC50值(6.036 mg/L)相當。本研究選擇LC10(1.330 mg/L)和LC25(2.715 mg/L)處理半閉彎尾姬蜂成蟲。

2.2 阿維菌素對寄生蜂成蟲體內(nèi)保護酶活性的影響

阿維菌素處理后1 h，寄生蜂體內(nèi)SOD活性與對照相比無顯著差異；處理后12、24和48 h，LC25處理寄生蜂體內(nèi)SOD活性升高，顯著大于對照；但到48 h，LC10處理SOD活性顯著升高，顯著大于對照和LC25處理(表1)。表明阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)SOD活性具有顯著誘導作用。

阿維菌素處理后1 h，寄生蜂體內(nèi)POD活性與對照相比無顯著差異；處理后12和24 h，LC10和LC25處理POD活性顯著大于對照；但到48 h，LC10處理POD活性顯著低于對照，而LC25處理顯著高于對照(表1)。說明阿維菌素LC10處理對POD活性具有先誘導后抑制的作用，而LC25處理表現(xiàn)為誘導作用。

阿維菌素處理后1 h，寄生蜂體內(nèi)CAT活性與對照相比顯著降低；處理后12 h，LC25濃度處理酶活性顯著升高；處理后24-48 h，LC10和LC25處理CAT活性均顯著大于對照，但二者沒有顯著差異(表1)。說明阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)CAT活性具有先抑制后誘導作用。

2.3 阿維菌素對寄生蜂成蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響

阿維菌素處理后1 h，LC25處理顯著抑制酯酶活性；12-24 h，LC10和LC25處理顯著抑制酯酶活性，且高濃度處理抑制作用大于低濃度處理；48 h，兩處理酯酶活性顯著低于對照，但二者之間酶活性沒有顯著差異(表2)。表明阿維菌素對寄生蜂成蟲體內(nèi)酯酶活性具有一定程度的抑制作用，且濃度越高抑制作用越強。

阿維菌素處理后1 h，GST活性沒有顯著變化；處理后12 h，LC10和LC25處理顯著抑制GST活性，且高濃度處理抑制作用更顯著；24 h，LC10處理組酶活性有所恢復，與對照無顯著差異，LC25處理顯著低于對照；處理后48 h，兩亞致死濃度處理GST活性顯著低于對照，濃度越高差異越顯著(表2)。說明阿維菌素對GST活性具有一定的抑制作用。

表1 亞致死濃度阿維菌素處理半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)保護酶活性變化

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。下表同。Note: Data are mean±SD. Different letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level. The same for the following table.

阿維菌素LC10和LC25處理后各時間段，MFO活性均顯著低于對照，但兩處理間差異不大，僅在處理后12 h，LC25處理酶活性大于LC10處理1.92 nmol/mg pro 30 min，處理后48 h，LC25處理酶活性低于LC10處理3.26 nmol/mg pro 30 min(表2)。說明阿維菌素對MFO具有顯著的抑制作用。

表2 亞致死濃度阿維菌素處理半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)解毒酶活性變化

3 結論與討論

昆蟲體內(nèi)的保護酶SOD、POD和CAT相互協(xié)調作用，清除昆蟲體內(nèi)的活性氧或過氧化物自由基，防御其對生物體的毒害，一旦保護酶系遭到破壞，生物體內(nèi)氧自由基濃度過高，將對細胞功能產(chǎn)生傷害作用(李周直等，1994；張友軍等，2003)。昆蟲體內(nèi)保護酶活性與外界刺激物的強度、昆蟲的耐藥性、抗逆性有關(王宏民等，2013)。楊瓊等(2015)報道LC10和LC20濃度的阿維菌素可促進異色瓢蟲Harmoniaaxyridis3齡幼蟲和成蟲體內(nèi)SOD活性升高，但對POD和CAT作用不明顯。朱先志等(2015)報道煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis成蟲對不同濃度吡蟲啉具有不同程度的應激反應，對SOD表現(xiàn)為先抑制后激活，對POD、CAT總體表現(xiàn)為先激活后抑制的作用。本研究結果表明，阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)SOD活性具有誘導作用，對POD活性總體表現(xiàn)為誘導作用，對CAT活性表現(xiàn)為先抑制后誘導作用。這表明半閉彎尾姬蜂成蟲可通過提高其體內(nèi)保護酶活性，抵御阿維菌素對自身的不利影響，提高其耐藥性。

EST、GST和MFO是昆蟲體內(nèi)的主要解毒酶系，可代謝各種內(nèi)源和外源有毒物質(如殺蟲劑、植物次生物質等)，提高昆蟲對殺蟲劑的耐藥性，解毒酶活性增強是昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的機制之一。研究表明，殺蟲劑可誘導昆蟲體內(nèi)解毒酶活性升高，提高蟲體對殺蟲劑的解毒代謝能力，如阿維菌素和高效氯氰菊酯可誘導小菜蛾體內(nèi)GST活性升高(梁沛等，2003)；阿維菌素亞致死劑量可提高2種色型豌豆蚜Acyrthosiphonpisum體內(nèi)GST和MFO的活性(王小強和劉長仲，2014)。但也有殺蟲劑通過抑制昆蟲體內(nèi)相關解毒酶活性從而達到殺蟲效果，如馬拉硫磷可抑制東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、全酯酶和GST的活性(趙霞等，2013)；甲胺磷可抑制菜蛾絨繭蜂Cotesiaplutellae體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和GST的活性(吳剛等，2002)。本研究也表明阿維菌素亞致死濃度可顯著抑制半閉彎尾姬蜂體內(nèi)EST、GST和MFO的活性，使其降解殺蟲劑的能力下降，從而增強了對寄生蜂的毒力。

Wu and Jiang(2004)認為菜蛾絨繭蜂對甲胺磷、呋喃丹、氰戊菊酯、氯菊酯、阿維菌素和氟蟲腈的耐藥性可能與羧酸酯酶、GST和MFO有關。Chiang and Sun(1991)曾試圖研究菜蛾絨繭蜂和半閉彎尾姬蜂體內(nèi)解毒酶活性與它們對某些殺蟲劑敏感性之間的關系，但沒有發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的相關性，盡管2種寄生蜂羧酸酯酶、GST和MFO活性比其寄主小菜蛾更低。植食性昆蟲對殺蟲劑的耐藥性可能來源于對寄主植物次生代謝物的解毒，解毒酶活性可被寄主植物的次生代謝物所誘導(Terriere, 1984)。由于沒有寄主植物次生代謝物的選擇壓力，寄生蜂的解毒酶活性可能比其植食性寄主更低。盡管如此，寄生蜂與害蟲一樣，在長期殺蟲劑的選擇壓下，其體內(nèi)解毒酶活性會升高，對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性。李元喜等(2002)通過施藥于體內(nèi)有寄生蜂的小菜蛾幼蟲獲得了對氰戊菊酯具有抗性的菜蛾絨繭蜂，其抗性與MFO活性升高有關。但本研究僅測定了阿維菌素對半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)解毒酶的短期影響，在長期阿維菌素的選擇壓力下，其體內(nèi)解毒酶活性是否會升高還有待于進一步研究。

本研究結果為探明半閉彎尾姬蜂對阿維菌素的防御反應提供了一定的理論依據(jù)，但是要明確其中的機制及保護酶和解毒酶的作用方式還有待于深入研究。

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Effect of sublethal concentrations of abamectin on protective and detoxifying enzymes inDiagegmasemclausum

JIABian-Tao,HONGShan-Shan,ZHANGYu-Chao,CAOYong-Wei

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,ShanxiProvince,China)

ToexploretheeffectofabamectinonprotectiveanddetoxifyingenzymesofDiadegma semiclausumHellen,alarvalparasitoidofdiamondbackmoth,theactivitiesofprotectiveanddetoxifyingenzymesweredeterminedaftertreatmentofD. semiclausumadultsfor1, 12, 24and48hourswithLC10andLC25concentrationsofabamectinusingresidualfilmmethod.Theresultsshowedthattheactivitiesofsuperxidasedismutase(SOD)andperoxidase(POD)weresignificantlypromotedwithincreasingtreatmenttimeandthecatalase(CAT)activitywasfirstlyinhibitedthenpromotedbysublethalconcentrationsofabamectin.Atthesametime,abamectinexposureinhibitedtheactivitiesofdetoxifyingenzymessignificantlyatmostoftreatmenttime.TheresultsprovidesometheorybasisforfurtherunderstandingdefensemechanismsofD. semiclausumagainstabamectin.

Abamectin; Diadegma semiclausum;protectiveenzymes;detoxifyingenzymes

山西省自然科學基金項目(2012011035-3)；山西農(nóng)業(yè)大學引進人才科研啟動基金項目(XB2007008)；山西省研究生創(chuàng)新項目(20143091)；山西省大學生創(chuàng)新項目(2014097)

賈變桃，女，1971年生，山西祁縣人，副教授，研究方向為農(nóng)藥毒理與害蟲抗藥性，E-mail: jiabtao@foxmail.com

Received：2015-11-10；接受日期Accepted：2016-02-01

Q965；S476

A

1674-0858(2016)05-0990-06