胡維娜，何廣位，李福霞，胡瓊波

(華南農業(yè)大學農學院，廣州510642)

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綠僵菌素A對家蠶cecropin B和gloverin 4基因表達的影響

胡維娜，何廣位，李福霞，胡瓊波*

(華南農業(yè)大學農學院，廣州510642)

綠僵菌素A(DA)是由金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae產(chǎn)生的一種環(huán)縮羧肽類次生化合物，具有抗昆蟲免疫作用，但是人們對其影響免疫相關基因調控的機理缺乏了解。本實驗以家蠶Bm12細胞為材料，采用RNAi技術沉默相關轉錄因子，結合熒光定量PCR(qPCR)技術，明確DA處理或沉默TOLL和IMD信號通路相關轉錄因子后抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因表達的變化。實驗發(fā)現(xiàn)，DA能引起抗菌肽cecropin B基因表達上調和gloverin 4基因表達下調。利用特異性siRNA分別沉默轉錄因子BmRelish1、BmRelish2、BmRel、BmFOXg1后，發(fā)現(xiàn)只有沉默轉錄因子BmRelish時，cecropin B和gloverin 4基因表達才下調，說明這兩種抗菌肽的合成均通過IMD信號通路調控。當沉默 BmRelish1或 BmRel基因及DA處理聯(lián)合作用時，cecropin B基因顯著下調，說明在抑制cecropin B合成時，DA與轉錄因子BmRelish1或者BmRel之間存在密切的協(xié)同效應；同樣，在促進gloverin 4合成時，DA與轉錄因子BmRelish2之間也存在著協(xié)同效應。

綠僵菌素A; Bm12 細胞; cecropin; gloverin

綠僵菌素(destruxins)是由金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae產(chǎn)生的一類環(huán)縮羧肽類次生代謝物質，具有殺蟲活性，也是綠僵菌的關鍵致病因子(Kershawetal., 1999; Pedrasetal., 2002)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)39種綠僵菌素同系物，其中綠僵菌素A和B(DA和DB)是最常見的同系物種類(Liu and Tzeng, 2012)。研究表明，綠僵菌素破壞昆蟲的先天性免疫系統(tǒng)，影響血細胞中的鈣離子與氫離子平衡(Chenetal., 2014)，影響血細胞的吞噬與囊胞化功能(Veyetal., 2002)，抑制果蠅抗菌肽合成(Paletal., 2007)，而且綠僵菌素A對家蠶漿血細胞與粒血細胞具有毒性(Chenetal., 2014; Fanetal., 2014)。但是，目前對綠僵菌素作用的分子機理并不清楚。

一般認為，Rel/NF-κB信號通路在昆蟲免疫中發(fā)揮著重要作用，Toll和Imd兩條通路均屬于Rel/NF-κB信號通路。昆蟲對真菌與革蘭氏陽性細菌的免疫響應通過TOLL信號通道激活，而革蘭氏陰性細菌則是通過激活IMD信號通路引起免疫響應。Rel蛋白是Toll通路中的下游的轉錄因子，它被激活后即進入細胞核，啟動抗菌肽等靶標基因的轉錄，Dorsal是Rel家族蛋白的重要代表，能高效調節(jié)抗菌肽的合成(張明明等, 2012；初源等, 2013)。家蠶BmRel基因通過選擇性剪切為 BmRelA和BmRelB兩個轉錄本，分別編碼Dorsal isoform A和Dorsal isoform B兩種蛋白(Tanakaetal., 2008;Suetsuguetal., 2013)。參與IMD信號轉導通路的Rel蛋白是Relish，家蠶的Relish1和Relish2基因分別編碼NF-κB p110 subunit isoform 1和NF-κB p110 subunit isoform 2兩種蛋白質(Tanakaetal., 2008；Suetsuguetal., 2013)，它們能調控抗菌肽基因的轉錄。另一個轉錄因子FOXg1，在細菌刺激后表達量會顯著變化，可能與免疫相關(Tanakaetal., 2010)。

DA處理家蠶血細胞后，影響B(tài)m_nscaf3098_42和Bm_nscaf1071_17基因表達，表達譜分析表明基因Bm_nscaf3098_42編碼葛佬素4前體(gloverin 4 precursor)，而基因Bm_nscaf1071_17編碼家蠶抗菌肽B前體(cecropin-B precursor)(Gongetal., 2014)。家蠶的葛佬素(gloverin)是一種富含甘氨酸的抗菌肽，具有熱穩(wěn)定性，對大腸桿菌、革蘭氏陽性細菌、真菌和病毒有生物活性，家蠶有4種Gloverin(Kanekoetal., 2007; Kawaokaetal., 2008; Yietal., 2013)。Cecropin-B屬于cecropins家族，對革蘭氏陽性與陰性細菌都有效，其肽鏈中堿性氨基酸主要分布在N-端，疏水基團主要分布在其C-端，在許多特定位置有較保守的殘基，如2位的色氨酸(Trp)，6、7位具一對賴氨酸(Lys)，4位具天冬酰胺(Asn)，6位具精氨(Arg)，不含半胱氨酸(Cys)和二硫橋；但在第8位為苯丙氨酸(Phe)，有別于其它的抗菌肽(陳玉清等, 2006; 周啟升等, 2011)。

因此，本研究以家蠶Bm12 細胞為材料，采用RNAi方法分別敲除BmRel、BmRelish1、BmRelish2、BmFOXg1等轉錄因子，考察綠僵菌素A對抗菌肽gloverin基因Bm_nscaf3098_42和cecropin基因Bm_nscaf1071_17表達的影響，增進對綠僵菌素作用機理的認識。

1 材料與方法

1.1 細胞與培養(yǎng)

供試細胞系：家蠶BombyxmoriBm12細胞由華南農業(yè)大學動科學院曹陽教授饋贈，采用TNM-FH培養(yǎng)基(Hyclone公司)加入10%胎牛血清(Gibco公司)，在27℃下恒溫培養(yǎng)傳代，每隔2-4 d傳代1次，取對數(shù)期細胞用于實驗。

1.2 綠僵菌素

綠僵菌素A(DA)由本實驗室從金龜子綠僵菌金龜子變種Metarhiziumanisopliaevar.anisopliae菌株MaQ10中分離純化(Huetal., 2006)。取DA 1 mg，加入100 μL二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)溶解，制成10000 μg/mL的綠僵菌素貯備液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 處理方法

小干涉RNA(siRNA)制備：根據(jù)目標基因的核苷酸序列，選擇3′端相鄰的核苷酸作為侯選的siRNA靶點，合成用于RNAi的小干涉RNA(siRNA)(上海英駿生物技術有限公司設計并合成)，包括針對轉錄因子BmRel、BmRelish1、BmRelish2和BmFOXg1的siRNA(表1)。

siRNA-lipo2000混合液的準備：將lipofectimine2000(Bio-Rad公司)輕輕搖勻，然后取2 μL，再用無血清TNM-FH培養(yǎng)基200 μL稀釋，輕輕混合，室溫孵育5 min；另取2 μL siRNA，用無血清TNM-FH培養(yǎng)基200 μL稀釋，輕輕混合；將孵育好的lipofectimine 2000與稀釋好的siRNA輕輕混合，室溫孵育20 min，形成siRNA-lipofectimine 2000混合液供細胞轉染實驗。

表1 用于沉默目標基因的小干涉RNA(siRNA)

細胞轉染：取對數(shù)生長期Bm12細胞接種至12孔板(美國Corning Incorporated 公司)，培養(yǎng)24 h 后，將培養(yǎng)液吸出，再加入無血清TNM-FH培養(yǎng)基100 μL，輕輕搖勻讓培養(yǎng)基鋪滿底部；取siRNA-lipofectimine 2000混合液400 μL，緩慢加入12孔板中，非轉染組則將200 μL孵育好的lipofectimine 2000與200 μL無血清TNM-FH培養(yǎng)基混勻，緩慢加入12孔板中，27℃下培養(yǎng)4 h，吸去上清液，終止轉染，更換新鮮的含血清TNM-FH培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h；再加入DA貯備液使培養(yǎng)液中DA的終濃度達到200 μg/mL，非DA處理組則加二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)對照使其終濃度達到0.1%，處理8 h后，提取細胞總RNA(RNA提取試劑盒：Omega公司)。RNA的純度與濃度采用SimpliNano微量分光光度計(GE Healthcare Life Science)進行檢測。

1.4 基因表達量分析

siRNA或DA處理的細胞作為實驗組，未經(jīng)轉染和DA處理的細胞作為對照，提取總RNA，實驗重復3次；qPCR方法參照Livak文獻(Livak and Schmittgen, 2001)，反應液體系為反轉錄的cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL(表2)，SYBR Premix Ex TaqTM(Bioscenece公司)10 μL，ddH2O 7 μL；反應程序為95℃預變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸30 s，39個循環(huán)后95℃ 10 s，65℃至95℃ 5 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法(Pfaffl, 2001)進行數(shù)據(jù)分析處理，利用家蠶GAPDH基因作為內參，具體計算公式：ΔΔCt = (Ct目標基因-Ct持家基因)實驗組-(Ct目標基因-Ct持家基因)對照組，實驗處理組中目標基因的相對表達量(Q)計算公式：Q = 2-ΔΔCt，實驗結果采用SPSS軟件(IBM，美國)分析基因相對表達量。

表2 內參基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)和家蠶待檢測基因引物

2 結果與分析

2.1 對轉錄因子的干擾效率

Bm12細胞被siRNA轉染24 h后，經(jīng)qPCR檢測 BmRel、 BmRelish1、 BmRelish2和 BmFOXg1基因顯著下調，干擾效率大于70%(圖1)。

圖1 siRNA對轉錄因子的干擾效率Fig. 1 siRNA to interference efficiency of transcription factors

2.2 綠僵菌素A與轉錄因子對cecropin B基因表達的影響

DA處理細胞8 h后，抗菌肽cecropin B基因Bm_nscaf1071_17表達量明顯上調(圖2)。沉默基因 BmRelish2后，cecropin基因Bm_nscaf1071_17顯著下調；而沉默基因 BmRelish1、 BmRel和BmFOXg1，cecropin基因表達量基本不變(圖2)。在敲除轉錄因子與DA聯(lián)合處理實驗中發(fā)現(xiàn)，先沉默 BmRelish1或 BmRel基因再用DA處理8 h(圖2中BmRelish1+DA和BmRel+DA)時，cecropin基因的表達水平顯著低于 BmRelish1、BmRel或DA各自單獨處理時的水平；而先沉默其他基因再用DA處理(圖2中BmRelish2+DA和BmFOXg1+DA)，cecropin基因的表達水平相較于轉錄因子或DA單獨處理時的水平未發(fā)生顯著上調或者下調現(xiàn)象(圖2)。

2.3 綠僵菌素A與轉錄因子對gloverin 4基因表達的影響

DA處理細胞8 h后，gloverin基因Bm_nscaf3098_42顯著下調(圖3)。沉默基因 BmRelish2后，gloverin 4基因Bm_nscaf3098_42顯著下調，而沉默基因 BmRelish1、 BmRel和 BmFOXg1后，基因顯著上調(圖3)。在敲除轉錄因子與DA聯(lián)合處理實驗中發(fā)現(xiàn)，先沉默 BmRelish2基因再用DA處理8 h(圖3中BmRelish2+DA)時，gloverin 4基因的表達水平顯著上調，顯著高于 BmRelish2或DA單獨處理時的水平；而先沉默其他基因再用DA處理(圖3中BmRelish1+DA、BmRel+DA、BmFOXg1+DA)，gloverin基因的表達水平總是介乎于轉錄因子或DA單獨處理時的水平之間(圖3)。

圖2 綠僵菌素A與轉錄因子對cecropin-B基因Bm_nscaf1071_17的表達量的影響Fig.2 Effect of destruxin A and transcription factors on Bm_nscaf1071_17 gene expression of cecropin B

圖3 綠僵菌素A與轉錄因子對抗菌肽gloverin基因Bm_nscaf3098_42表達量的影響Fig. 3 Effect of destruxin A and transcription factors on Bm_nscaf3098_42 gene expression of gloverin 4

3 結論與討論

實驗表明，DA處理Bm12細胞后，cecropin B基因顯著上調表達，而gloverin 4基因顯著下調表達。家蠶的cecropin 的抗菌譜較廣，對革蘭氏陰性細菌、陽性細菌及真菌均有活性(孫偉等, 2009; Yangetal., 2011)，DA又是蟲生真菌-綠僵菌產(chǎn)生的毒素，所以家蠶在DA刺激下，可能激發(fā)cecropin B的合成，有利于家蠶抵御蟲生真菌的侵染，而gloverin 只對革蘭氏陰性細菌具有活性，因此家蠶在DA刺激下不會激發(fā)gloverin 4的合成。

沉默轉錄因子基因BmRelish2后，cecropin B基因Bm_nscaf1071_17顯著下調，而沉默 BmRelish1、BmRel和 BmFOXg1轉錄因子基因后，該基因表達量基本不變。這一結果說明cecropin B的生物合成是通過IMD信號通路調控的，轉錄因子BmRelish2在發(fā)揮著關鍵作用，而轉錄因子BmRelish1為什么對cecropin B基因表達影響不顯著，也許是因為該基因未參與供試細胞Bm12細胞的IMD信號通路，抑或是其他更復雜的原因。然而，在進一步的轉錄因子沉默與DA處理聯(lián)合實驗中，先沉默 BmRelish1或 BmRel基因再用DA處理(圖2中BmRelish1+DA和BmRel+DA)時，cecropin B基因的表達水平顯著低于 BmRelish1、BmRel或DA各自單獨處理時的水平，這個結果暗示DA與轉錄因子BmRelish1或者BmRel之間存在強烈的直接或間接的相互作用，從而強烈抑制cecropin B的合成。毫無疑問，DA與轉錄因子BmRelish1或者BmRel之間的關系值得進一步深入研究。

已有研究表明，gloverin也是通過TOLL信號通路調控的，因為斜紋夜蛾Spodopteraexigua的Toll基因SeToll被沉默后，gloverin的合成被抑制(Park and Kim, 2012)。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子BmRelish2被沉默后，gloverin 4基因顯著下調，而沉默轉錄因子BmRelish1、BmRel和BmFOXg1后，該基因又顯著上調，這個結果說明gloverin 4的合成是通過IMD信號通路調控，但TOLL信號通路可能也發(fā)揮某些作用，可見抗菌肽合成的調控機理是相當復雜的。先沉默 BmRelish2基因再用DA處理后，gloverin 4基因的表達水平顯著高于 BmRelish2或DA單獨處理時的水平，這個結果表明，在調控gloverin 4的合成時，DA與轉錄因子BmRelish2之間存在強烈的直接或間接的相互作用。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)，綠僵菌素A處理后，引起家蠶Bm12細胞抗菌肽cecropin B基因表達上調和gloverin 4基因表達下調，家蠶細胞在DA刺激后，能夠啟動cecropin B基因表達，增強其體內的抗真菌能力。沉默轉錄因子 BmRelish2基因后，cecropin B和gloverin 4基因均下調表達，說明這兩種抗菌肽的合成均通過IMD信號通路調控。沉默 BmRelish1或 BmRel基因及DA處理聯(lián)合作用時，cecropin B基因顯著下調，說明在抑制cecropin B的合成時，DA與轉錄因子BmRelish1或者BmRel之間存在密切的協(xié)同效應。同樣，在促進gloverin 4的合成時，DA與轉錄因子BmRelish2之間也存在著協(xié)同效應。揭示DA與這些轉錄因子之間相互作用調控家蠶抗菌肽cecropin B和gloverin 4的合成的機理，將有助于解析綠僵菌素的作用機制及綠僵菌的致病機理，從而有助于真菌生物防治劑的開發(fā)與應用。

致謝:感謝華南農業(yè)大學動物科學學院曹陽教授饋贈Bm12細胞。

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Effect of destruxin A on expression of cecropin B and gloverin 4 genes of silkworm

HU Wei-Na, HE Guang-Wei, LI Fu-Xia, HU Qiong-Bo*

(College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Destruxin A (DA), a cyclodepsipeptidic mycotoxin isolated from entomopathogenic fungus,Metarhiziumanisopliae, has anti-immunity activity against insects, but the mechanism of immune regulation is not clear yet. In the current experiment, by means fluorescence quantitative PCR (qPCR), the silkworm cell line Bm12 was used to survey the expression level of antimicrobial peptides cecropin B and gloverin 4 genes after the cells treated with DA or silence of transcription factors in TOLL and IMD signal pathways. The results indicated that the cecropin B gene was up-regulated and gloverin 4 gene was down-regulated after the DA treatment. Respectively silencing transcription factors BmRelish1, BmRelish2, BmRel, BmFOXg1 with specific siRNA, found that after only the transcription factorsBmRelish2 gene was silenced, cecropin B and gloverin 4 genes were all down-regulated. This illustrated that the two antimicrobial peptides were biosynthesized through IMD signal pathway. Furthermore, when the silence of transcription factorsBmRelish1 orBmRelgenes and DA treatment were combined, cecropin B gene was significantly down-regulated, which suggested that there were some synergism between DA and transcription factors BmRelish1 or BmRel to inhibit the biosynthesis of cecropin B. Similarly, there were close synergistic relations between DA and transcription factors BmRelish2 to promote the biosynthesis of gloverin 4.

Destruxins A; Bm12 cell; cecropin; gloverin

1674-0858(2016)05-0984-06

國家自然科學基金面上項目(31272057)

胡維娜，女，1990年生，河南周口人，碩士生，研究方向為昆蟲毒力，E-mail: hwn688094@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: hqbscau@scau.edu.cn

Received: 2015-11-11; 接受日期 Accepted: 2016-03-14

Q965；S476

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