陳斯瑋，王　芳，章　卓，張　丹（西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州　646000）

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化川佛手揮發(fā)油的超臨界CO2萃取工藝Δ

陳斯瑋＊，王芳，章卓，張丹#（西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000）

目的：優(yōu)化川佛手揮發(fā)油成分超臨界CO2萃取的提取工藝。方法：以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，分別考察萃取溫度、萃取壓力、CO2流量、萃取時(shí)間、分離壓力和分離溫度等單因素對(duì)川佛手揮發(fā)油得率的影響。在此基礎(chǔ)上，選取影響顯著的萃取溫度、萃取壓力、CO2流量和萃取時(shí)間4個(gè)因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取工藝參數(shù)。結(jié)果：在萃取溫度67、萃取壓力57 MPa、CO2流量22 L/h和萃取時(shí)間4 h時(shí)，川佛手揮發(fā)油超臨界CO2萃取得率最高，達(dá)到1.892%（n＝3），與預(yù)測(cè)值（1.937%）的相對(duì)誤差為2.32%。結(jié)論：優(yōu)選的川佛手揮發(fā)油的超臨界CO2萃取工藝合理、可行。

Box-Behnken響應(yīng)面法；川佛手；揮發(fā)油；超臨界CO2萃取

中藥佛手Citrisarcodactylis fructus始載于《本草綱目》，為蕓香科植物佛手Citrus Medica L.var sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)。佛手因產(chǎn)地不同有廣佛手、川佛手、金佛手之分。川佛手為四川道地中藥材，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰之功效[1]。揮發(fā)油為川佛手主要的藥效成分，具有抗腫瘤、抑制黑色素、抗菌、抗氧化、提高免疫力、止咳平喘等作用[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，佛手揮發(fā)油對(duì)人肝癌Hep3B、Huh7，骨髓瘤SP20，肺癌A549，人胰腺癌PANC-28，黑色素瘤B16，人乳腺癌MDA-MB-435等瘤株均有不同程度的抗腫瘤活性[5-6]。如何有效提高川佛手萃取過程中的揮發(fā)油含量，一直是川佛手研究的熱點(diǎn)。因此，在本研究中筆者以川佛手揮發(fā)油的得率為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)其超臨界CO2萃取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[7-8]，為改進(jìn)川佛手揮發(fā)油生產(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1儀器

HA221-50-01超臨界流體萃取設(shè)備（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；ZWH-2S機(jī)械粉碎機(jī)（河南天鴻機(jī)械廠）；DYYB-10系列臺(tái)式冷凍干燥機(jī)（上海德洋意邦儀器有限公司）；恒平HT12電子臺(tái)秤（無錫市恒平工業(yè)設(shè)備有限公司）。

1.2藥材與試劑

川佛手（瀘州天植中藥飲片有限公司，批號(hào)：20150405-009）經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)生藥教研室莊元春副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus Medica L.var sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)；CO2（瀘州客隆生物技術(shù)有限公司，純度：＞99.9%）。

2　方法與結(jié)果

2.1藥材的處理與揮發(fā)油得率的計(jì)算

將新鮮川佛手果經(jīng)冷凍干燥后粉碎，過60目篩備用。每次精密稱定100 g川佛手粉末裝入超臨界萃取裝置，收集分離產(chǎn)物并計(jì)算揮發(fā)油得率。揮發(fā)油得率（%）＝揮發(fā)油質(zhì)量（g）/川佛手生藥質(zhì)量（g）×100%。

2.2單因素試驗(yàn)考察

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果[9-12]，預(yù)先設(shè)定萃取溫度為80、萃取壓力為50 MPa、分離溫度為50、分離壓力為15 MPa、CO2流量為20 L/h、萃取時(shí)間為3 h。之后保持其他因素不變，依次改變萃取壓力為10、30、50、70、90 MPa，萃取溫度為50、65、80、95、110，CO2流量為10、20、30、40、50 L/h，分離壓力為10、15、20、25、30 MPa，分離溫度為25、35、45、55、65、75，萃取時(shí)間為1、2、3、4、5 h，考察上述因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響。單因素試驗(yàn)考察結(jié)果見圖1。

圖1　各因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響a.萃取壓力；b.萃取溫度；c.CO2流量；d.分離壓力；e.分離溫度；f.萃取時(shí)間Fig 1　Effects of factors on the yield of volatile oila.extraction pressure；b.extraction temperature；c.CO2flow；d.separation pressure；e.separation temperature；f.extraction time

由圖1a可見，揮發(fā)油得率隨萃取壓力的升高逐漸增加，當(dāng)萃取壓力達(dá)到50 MPa后增加趨勢(shì)逐漸變緩，故選擇萃取壓力為50 MPa。由圖1b可見，揮發(fā)油得率隨萃取溫度的上升逐漸增加，當(dāng)萃取溫度達(dá)到65時(shí)得率最大，之后則逐漸降低，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是溫度過高，揮發(fā)油損耗增加，從而導(dǎo)致得率下降，故選擇萃取溫度為65。由圖1c可見，揮發(fā)油得率隨CO2流量的增大逐漸增加，當(dāng)CO2流量達(dá)到20 L/h后增加趨勢(shì)逐漸變緩，故選擇CO2流量為20 L/h。由圖1d和圖1e可見，分離壓力和分離溫度對(duì)揮發(fā)油得率的影響較小。由圖1f可見，揮發(fā)油得率與萃取時(shí)間成正相關(guān)，且1～3 h內(nèi)增加明顯，3 h后增加趨勢(shì)逐漸變緩，故選擇萃取時(shí)間為3h。

2.3Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以萃取壓力（A，MPa）、萃取溫度（B，）、CO2流量（C，L/ h）、萃取時(shí)間（D，h）4個(gè)因素為響應(yīng)因子，以川佛手揮發(fā)油得率（%）為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2　Design and results of test

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，設(shè)4個(gè)因素29個(gè)試驗(yàn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次。由表3方差分析結(jié)果可得出，影響揮發(fā)油得率的主次因素順序?yàn)椋篈＞D＞C＞B；A、C、D、BC、A2、C2、B2對(duì)揮發(fā)油得率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。揮發(fā)油得率的回歸方程Y＝1.86+0.82A+ 0.025B+0.064C－0.071D+0.073AB+0.030AC－0.066AD+ 0.042BC+0.028BD－0.018CD+0.33A2－0.17B2+0.054C2+ 0.037D2（R2＝0.896 8）。模型P＝0.000 1＜0.001，說明各響應(yīng)值對(duì)該模型的影響是顯著的。失擬項(xiàng)P＝0.099 7＞0.05，為不顯著，說明回歸方程和試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，可應(yīng)用該回歸方程對(duì)不同萃取條件下川佛手揮發(fā)油得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過回歸方程預(yù)測(cè)的揮發(fā)油萃取的最優(yōu)工藝條件為：萃取壓力56.68 MPa、萃取溫度67.33、CO2流量22.14 L/h，萃取時(shí)間4 h。在此條件下，預(yù)測(cè)川佛手揮發(fā)油得率為1.937%。

表3　方差分析結(jié)果Tab 3　Results of variance analysis

當(dāng)萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時(shí)間中有2個(gè)因素為固定值時(shí)，繪制其他2個(gè)因素及其交互作用對(duì)揮發(fā)油得率影響的響應(yīng)面及等高線圖。其中，以CO2流量與萃取溫度的交互作用較顯著，結(jié)果見圖2，其余因素交互作用不顯著（圖略）。

圖2　CO2流量與萃取溫度對(duì)揮發(fā)油得率影響的三維響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 2　Three-dimensional response surface and contour of the CO2flow and extraction temperature on the extraction rate of volatile oil

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，最終確定川佛手揮發(fā)油的超臨界CO2萃取工藝條件為：萃取壓力57 MPa，萃取溫度67，CO2流量22 L/ h，萃取時(shí)間4 h。按此條件分別進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果川佛手揮發(fā)油得率的平均值為1.892%（RSD＝0.68%，n＝3），與預(yù)測(cè)值（1.937%）相比，相對(duì)誤差為2.32%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，說明模型可靠。

3　討論

中藥揮發(fā)油成分的萃取，目前主要有水蒸氣蒸餾、微波提取法、壓榨法、溶劑法以及超臨界萃取法，尤其是近年來興起的超臨界CO2萃取法，具有效率高、萃取速度快、工藝和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合于一些對(duì)熱敏感、容易氧化分解破壞的成分的提取和分離。在最優(yōu)工藝條件下，可以將所需成分幾乎完全提出，從而提高產(chǎn)品的回收率和資源的利用率[13-14]。同時(shí)，由于萃取工藝簡單、無污染，分離后的超臨界流體經(jīng)精制可循環(huán)使用，故其在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用越來越廣泛。響應(yīng)面法作為一種有效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可進(jìn)行多因素多水平試驗(yàn)研究，并可研究因素間的交互作用，根據(jù)綜合指標(biāo)得到最優(yōu)工藝，避免了常規(guī)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)只能對(duì)單個(gè)因素水平進(jìn)行分析以及無法給出直觀圖形的缺陷[15]。在揮發(fā)油萃取領(lǐng)域，超臨界CO2萃取技術(shù)與響應(yīng)面法的結(jié)合在中藥生產(chǎn)研究中有著廣泛的應(yīng)用。因此在本試驗(yàn)中，筆者利用響應(yīng)面法中Box-Behnken模式設(shè)計(jì)，以川佛手揮發(fā)油得率為指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法考察萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時(shí)間4個(gè)主要因素對(duì)川佛手揮發(fā)油超臨界CO2萃取工藝的影響，并對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，取得了較好的結(jié)果。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of SFE-CO2Extraction Technology of Volatile Oil from Citrisarcodactylis fructus by Box-Behnken-response Surface Methodology

CHEN Siwei，WANG Fang，ZHANG Zhuo，ZHANG Dan（College of Pharmacy，Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To optimize SFE-CO2extraction technology of volatile oil from Citrisarcodactylis fructus.METHODS：Using the yield of volatile oil as index，the influences of extraction temperature，extraction pressure，CO2flow，extraction time，acquisition pressure and acquisition temperature on the yield of volatile oil were investigated.Moreover，4 significant factors，such as extraction temperature，extraction pressure，CO2flow and extraction time，were selected；the parameters of SFE-CO2extraction technology were optimized by Box-Behnken design-response surface methodology.RESULTS：The results showed that the highest extraction rate could be obtained with extraction temperature at 67，extraction pressure at 57 MPa，CO2flow at 22 L/h and extraction time for 4 h.The highest extraction rate was 1.892%（n＝3），and the relative error between it and predicted value（1.937%）was 2.32%.CONCLUSIONS：Optimized SFE-CO2extraction technology for volatile oil from C.fructus is reasonable and feasible.

Box-Behnken-response surface methodology；Citrisarcodactylis fructus；Volatile oil；SFE-CO2extraction

R284.2

A

1001-0408（2016）28-3973-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.26

四川省教育廳科研項(xiàng)目（No.16ZB0205）

＊講師，碩士。研究方向：中藥新制劑、新工藝。電話：0830-3190325。E-mail：6746763@qq.com

副教授，博士。研究方向：中藥制劑與炮制。E-mail：393335427@qq.com

（2016-01-04

2016-08-16）