董永喜，董　莉，付思紅，劉宗炎，王愛民，李勇軍，蘭燕宇（1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽　550004；.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴陽　550004）

辛芍組方對氧糖剝奪損傷的神經(jīng)PC12細胞凋亡的影響及其機制研究Δ

董永喜1，2＊，董莉1，2#，付思紅1，2，劉宗炎1，2，王愛民2，李勇軍2，蘭燕宇2（1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽550004；2.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴陽550004）

目的：考察辛芍組方對氧糖剝奪（OGD）損傷的神經(jīng)PC12細胞凋亡的影響，并探討其作用機制。方法：采用連二亞硫酸鈉培養(yǎng)PC12細胞建立OGD損傷模型，將OGD損傷的細胞分為模型組（空白培養(yǎng)基）、尼莫地平組（陽性藥物，0.42 mg/L）和辛芍組方低、中、高濃度組[質量濃度分別為0.313、0.625、1.25 mg（生藥）/L]，并取正常細胞作為正常對照組（空白培養(yǎng)基）。各組細胞經(jīng)藥物作用4 h，再復糖復氧4 h后采用MTT法檢測細胞存活率，比色法測定乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量，流式細胞術檢測細胞凋亡率和線粒體膜電位（MMP），并采用Western blot法檢測細胞凋亡相關基因Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達。結果：與正常對照組比較，模型組細胞的存活率、MMP、Bcl-2蛋白表達水平以及Bcl-2/Bax比值顯著降低，而LDH釋放量、細胞凋亡率以及Caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，辛芍組方可增加細胞的存活率和MMP，降低LDH的釋放量和凋亡率，顯著抑制Caspase-3和Bax蛋白表達水平，升高Bcl-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值；除辛芍組方低濃度組細胞的MMP、Bcl-2和Bax外，其余各給藥組細胞上述指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論：辛芍組方對OGD損傷誘導的PC12細胞凋亡具有抑制作用，其機制可能與減少LDH釋放、穩(wěn)定細胞MMP、調(diào)節(jié)凋亡相關基因的表達有關。

辛芍組方；氧糖剝奪；神經(jīng)PC12細胞；凋亡；凋亡相關基因；線粒體膜電位

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年有1 500萬人患腦卒中，而65歲以上的人為高危人群[1]。腦卒中是心血管疾病患者致死、致殘的主要原因，在臨床上多以偏癱的形式出現(xiàn)。腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中最為常見，占腦卒中的80%～85%[2]。隨著對腦缺血病理生理機制研究的不斷深入，細胞凋亡在缺血引發(fā)的神經(jīng)元損傷和死亡過程中的作用受到越來越多的重視。神經(jīng)PC12細胞源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，具有多種神經(jīng)細胞特性，被廣泛用于神經(jīng)藥理學方面的研究。

辛芍組方源于民間驗方，由燈盞細辛和赤芍配伍組成，且燈盞細辛和赤芍提取物對神經(jīng)細胞損傷均有不同程度的保護作用，在民間多用于治療偏癱，有較好的臨床基礎。本課題組在前期對辛芍組方進行了一系列的研究[3-9]，發(fā)現(xiàn)該方具有軟化、擴張血管及抗凝血的作用，而且還明確了辛芍組方發(fā)揮對氧糖剝奪（OGD）損傷PC12細胞保護作用的最佳配比[10]。本研究在此基礎上，以連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）復制OGD損傷的PC12細胞模型，考察辛芍組方對OGD損傷的PC12細胞凋亡的影響及其作用機制，為進一步闡明該方發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制提供參考。

1　材料

1.1儀器

680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；TS-100F型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo公司）。

1.2藥品與試劑

燈盞細辛提取物[批號：20150908，規(guī)格：21.3 g（生藥）/g，采用高效液相色譜法測得其中含野黃芩苷64.28%、3，5-二咖啡酰基奎寧酸8.36%]、赤芍提取物[批號：20150916，規(guī)格：28.9 g（生藥）/g，采用高效液相色譜法測得其中含芍藥苷65.04%、芍藥內(nèi)酯苷3.35%]均由貴州省藥物制劑重點實驗室提供；尼莫地平注射液（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJP2013042/37，規(guī)格：10 mg∶50 ml）；MTT（美國Sigma公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號：20130625）；熒光素FITC標記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ-FITC）/碘化丙啶（PI）雙染凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位（MMP）檢測試劑盒（上海貝博生物公司，批號：BB150061、BB150071）；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）、B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）；蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：00041409、00051308）。

1.3細胞

神經(jīng)PC12細胞購自中國科學研究院上海細胞所。

2　方法

2.1供試品的制備

辛芍組方由燈盞細辛與赤芍按質量比為2∶3進行組方[8，10]，以滅菌超純水為溶劑，二甲基亞砜（DMSO）助溶制備成總質量濃度為10mg/ml的母液，備用。

2.2細胞培養(yǎng)及傳代

PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、5%馬血清、96 mg/L青霉素和160 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合至80%時，用0.25%胰酶溶液消化傳代。

2.3細胞存活率測定

采用MTT法。取對數(shù)生長期細胞，以3×104～4×104ml－1的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，孵育24 h后，將細胞分為正常對照組（空白培養(yǎng)液）、模型組（空白培養(yǎng)液）、尼莫地平組（陽性藥物，0.420 mg/L）和辛芍組方低、中、高濃度組[質量濃度分別為0.313、0.625、1.250 mg（生藥）/L]。模型組、尼莫地平組和辛芍組方各濃度組細胞分別加入含30 mmol/L Na2S2O4的無糖DMEM培養(yǎng)液100 μl，正常對照組加入100 μl正常DMEM培養(yǎng)液。孵育4 h后，各組細胞均更換為正常DMEM培養(yǎng)液，復糖復氧繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入100 μl MTT溶液，于酶標儀490 nm波長處測定光密度（OD），計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝試驗組OD值/正常對照組OD值×100%。每組設6個復孔，試驗重復3次。

2.4細胞上清液中LDH含量測定

細胞接種、分組、培養(yǎng)以及造模的方法均同“2.3”項下。在復糖復氧4 h后，取上清液，按照試劑盒說明書測定細胞上清液中LDH含量。每組設6個復孔，試驗重復3次。

2.5細胞凋亡率測定

采用比色法。細胞接種、分組、培養(yǎng)以及造模的方法均同“2.3”項下。在復糖復氧4 h后，消化收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，AnnexinⅤ結合液懸浮細胞，再加入5 μl AnnexinⅤ-FITC染色液，置于細胞培養(yǎng)箱中避光孵育15 min后，加入5 μl PI染色液避光孵育5 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，試驗重復3次。

2.6 細胞中MMP測定

采用流式細胞術。細胞接種、分組、培養(yǎng)以及造模的方法均同“2.3”項下。復糖復氧4 h后，消化收集細胞，PBS洗2遍，每個樣本用JC-1工作液重懸細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育15 min，離心收集細胞。重懸細胞后用流式細胞儀檢測熒光強度，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm。每組設3個復孔，試驗重復3次。

2.7細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平測定

采用Western blot法。細胞接種、分組、培養(yǎng)以及造模的方法均同“2.3”項下。復糖復氧培養(yǎng)4 h后，按照蛋白抽提試劑盒說明書提取蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜及封閉后，分別加入Caspase-3（1∶400）、Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）一抗，4℃孵育過夜，用含HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）孵育1.5 h。增強化學發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，通過Gene Tools分析軟件進行灰度值分析，以目的基因灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示目的基因的相對表達水平。每組設3個復孔，試驗重復3次。

2.8統(tǒng)計學方法

3　結果

3.1辛芍組方對OGD損傷的PC12細胞存活率和LDH釋放量的影響

與正常對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低、上清液中LDH釋放量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組細胞的存活率顯著升高、LDH釋放量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），且呈濃度依賴性。各組細胞的存活率和上清液中LDH含量測定結果見表1。

表1　各組細胞的存活率和上清液中LDH含量測定結果（±s，n＝3）Tab 1　Survival rate and LDH content in supernatants of cells in each group（±s，n＝3）

表1　各組細胞的存活率和上清液中LDH含量測定結果（±s，n＝3）Tab 1　Survival rate and LDH content in supernatants of cells in each group（±s，n＝3）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

LDH，U/L 組別　存活率，%

3.2辛芍組方對OGD損傷的PC12細胞凋亡率和MMP的影響

與正常對照組比較，模型組細胞的凋亡率顯著升高、細胞中MMP顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組細胞的凋亡率均有不同程度降低、細胞中MMP均不同程度升高，且與辛芍組方呈現(xiàn)一定的質量濃度依賴性；除辛芍組方低濃度組細胞的MMP升高不顯著外（P＞0.05），其余各組細胞上述指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組細胞的凋亡率和MMP測定結果見表2、流式細胞圖見圖1、圖2。

表2　各組細胞的凋亡率和MMP測定結果（±s，n＝3）Tab 2　The apoptosis rate and MMP of cells in each group（±s，n＝3）

表2　各組細胞的凋亡率和MMP測定結果（±s，n＝3）Tab 2　The apoptosis rate and MMP of cells in each group（±s，n＝3）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

MMP 組別　凋亡率，%

圖1　細胞凋亡的流式細胞圖Fig 1　Flow cytometry of apoptosis

圖2　細胞MMP的流式細胞圖Fig 2　Flow cytometry of cells MMP

3.3辛芍組方對OGD損傷的PC12細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平以及Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組細胞上述指標均得到不同程度改善；除辛芍組方低濃度組細胞中Bcl-2、Bax蛋白水平和Bcl-2/Bax比值，以及辛芍組方中濃度組細胞中Bcl-2蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）外，其余各組各指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平以及Bcl-2/ Bax比值測定結果見表3，蛋白表達電泳圖見圖3。

表3　各組細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平以及Bcl-2/Bax比值測定結果（±s，n＝3）Tab 3　The protein expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax and the ratio of Bcl-2/Bax of cells in each group（± s，n＝3）

表3　各組細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平以及Bcl-2/Bax比值測定結果（±s，n＝3）Tab 3　The protein expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax and the ratio of Bcl-2/Bax of cells in each group（± s，n＝3）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

Bcl-2/Bax 1.35±0.04 0.53±0.12＊0.73±0.09 0.86±0.06#0.92±0.02#1.12±0.13##組別正常對照組模型組辛芍組方低濃度組辛芍組方中濃度組辛芍組方高濃度組尼莫地平組Caspase-3/β-actin 0.59±0.09 6.75±0.36＊＊5.39±0.42#4.28±0.14##3.77±0.13##2.73±0.28##Bcl-2/β-actin 1.19±0.11 0.54±0.14＊＊0.70±0.11 0.76±0.06 0.78±0.01#0.89±0.12#Bax/β-actin 0.88±0.08 1.01±0.02＊0.98±0.09 0.88±0.01##0.85±0.02##0.79±0.02##

圖3　各組細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的電泳圖Fig 3　The electrophoregrams of protein expression of Caspase-3，Bax and Bcl-2of cells in each group

4　討論

Na2S2O4是一種氧清除劑，能清除融入培養(yǎng)基質中的氧，在短時間內(nèi)即可造成細胞缺氧。采用Na2S2O4結合無糖培養(yǎng)基的方法模擬缺氧缺糖環(huán)境，作用于PC12細胞4 h后，再更換為正常含糖的培養(yǎng)基，恢復氧、糖供應，從而建立PC12細胞的OGD損傷模型[4]。尼莫地平為鈣拮抗藥，用于缺血性腦血管病、偏頭痛、輕度蛛網(wǎng)膜下腔出血所致腦血管痙攣等疾病的治療，療效明確，常在抗腦缺血藥物研究中被作為陽性對照藥物。課題組在前期試驗中考察了不同濃度尼莫地平對OGD損傷的PC12細胞的保護作用，結果表明，當尼莫地平濃度為1 μmol/L（即0.420 mg/L）時可以顯著改善OGD所致的PC12細胞損傷，與文獻[11-12]報道一致。因此，在本試驗中設置尼莫地平的質量濃度為0.420mg/L。

MTT法主要用于測定藥物對體外培養(yǎng)細胞的活性。其原理是當有活細胞存在時，線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成藍紫色的針狀甲臜結晶；結晶物能被DMSO溶解，用酶標儀測定其OD值，OD值越大，表示存活的細胞越多[3]。LDH釋放量的測定是在LDH的作用下，NAD+被還原生成的NADH，再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑在硫辛酰胺脫氫酶的催化下反應生成強生色物甲臜，在490 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而確定釋放的LDH的活性，LDH釋放量的增加是細胞受損的指標[3]。因此，細胞存活率和LDH釋放量是作為評價細胞損傷的常用指標。本試驗結果顯示，辛芍組方能夠呈濃度依賴性地升高OGD損傷的PC12細胞存活率、抑制細胞中LDH釋放。線粒體是細胞的產(chǎn)能供能中心，MMP可反映細胞內(nèi)線粒體功能狀態(tài)。在細胞凋亡的過程中往往伴隨著MMP的破壞，MMP降低是細胞凋亡過程中的早期事件之一[13]。本試驗結果顯示，辛芍組方可降低細胞的凋亡率、穩(wěn)定細胞MMP，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

Bcl-2家族與細胞凋亡緊密相關，抗凋亡蛋白Bcl-2是其中最重要的蛋白之一，其與MMP的改變密切相關；而促凋亡蛋白Caspase-3、Bax能使線粒體膜通透性增加，致使MMP降低，從而引起細胞凋亡。故Bcl-2和Bax蛋白表達水平的高低與細胞凋亡的嚴重性相關，二者比值越低，細胞凋亡越嚴重[14-15]。本試驗結果顯示，辛芍組方能降低細胞中Caspase-3、Bax蛋白水平，升高細胞中Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax比值，且呈一定的濃度依賴性。

綜上所述，辛芍組方對OGD誘導的PC12細胞具有明顯的保護作用，其機制可能與減少細胞LDH釋放、穩(wěn)定細胞MMP、調(diào)節(jié)凋亡相關基因的表達有關。

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（編輯：林靜）

Effects of Xinshao Formula on the Apoptosis of Oxygen-glucose Deprivation-induced Nerve PC12 Cells and Its Mechanism

DONG Yongxi1，2，DONG Li1，2，F(xiàn)U Sihong1，2，LIU Zongyan1，2，WANG Aimin2，LI Yongjun2，LAN Yanyu2（1.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；2.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of Xinshao formula on the apoptosis of oxygen-glucose deprivation（OGD）-induced PC12 cells，and to investigate its mechanism.METHODS：PC12 cells were cultured by Na2S2O4to establish OGD model. OGD-induced cells were divided into model group（blank medium），nimodipine group（positive drug，0.42 mg/L）and Xinshao formula low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups[0.313，0.625，1.25 mg（crude drug）/L]；normal cells were included in normal control group（blank medium）.MTT assay was used to determine the survival rate of PC12 cells after treated with drugs for 4 h and then oxygen-glucose restoration for 4 h.The release of LDH was detected by colorimetric method. The apoptosis rate and mitochondrial membrane potential（MMP）were detected by flow cytometry.The protein expression of Caspase-3，Bax and Bcl-2 were examined by Western blot.RESULTS：Compared with normal control group，the survival rate，MMP，the protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax were decreased significantly in model group；while the release of LDH，apoptosis rate，protein expression of Caspase-3 and Bax were increased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，the survival rate，MMP，the protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax were increased in Xinshao formula groups；while the release of LDH，apoptosis rate，protein expression of Caspase-3 and Bax were decreased.The above indexes had significant differences except for MMP，Bcl-2 and Bax in Xinshao formula low-concentration group（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Xinshao formula can inhibit the apoptosis of OGD-induced PC12 cells，which may be related to reducing the release of LDH，keeping MMP stable and regulating the expression of apoptotic-related gene.

Xinshao formula；Oxygen-glucose deprivation；Nerve PC12 cells；Apoptosis；Apoptotic-related gene；Mitochondrial membrane potential

R285

A

1001-0408（2016）28-3907-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.06

國家自然科學基金資助項目（No.81260636，81060335）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金項目（No.黔科合人字〔2015〕11號）；貴州省高等學校創(chuàng)新能力提升計劃項目（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字〔2013〕04）；貴州省教育廳基金項目（No.黔科合KY字〔2013〕122）

＊講師，碩士。研究方向：心血管藥物設計與合成。電話：0851-88416153。E-mail：dongyx01@163.com

副教授，碩士。研究方向：中藥藥效學、藥理學研究和安全性評價。電話：0851-88416153。E-mail：108405755@qq.com

（2016-04-20

2016-06-17）