王麗娟 路軍章李明偉 牛寶龍 曲寶林

（解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

復(fù)方竹葉石膏顆粒對(duì)急性放射性食管損傷家兔免疫功能的調(diào)節(jié)作用*

王麗娟 路軍章△李明偉 牛寶龍 曲寶林

（解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

目的 觀察復(fù)方竹葉石膏顆粒對(duì)急性放射性食管損傷家兔免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法 40只清潔級(jí)雄性家兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純照射組（模型組）、復(fù)方竹葉石膏組、康復(fù)新液組，每組10只，除空白對(duì)照組以外，其余組家兔均以直線加速器6MV-X線一次照射32 Gy，建立家兔急性放射性食管損傷模型，各組均按不同治療方法于照射前1周灌胃至照射完成后1周結(jié)束，每日1次。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+百分比，用免疫濁度法檢測(cè)IgG及補(bǔ)體C3的含量。結(jié)果 放射線導(dǎo)致急性放射性食管損傷家兔血中CD4+與CD8+的百分比、CD4+/CD8+值和IgG與補(bǔ)體C3的水平降低；與模型組比較，藥物組提高家兔外周血CD4+、CD4+/ CD8+、IgG及補(bǔ)體C3的值（P＜0.05）；與康復(fù)新組比較，復(fù)方竹葉石膏顆粒組在提高IgG與補(bǔ)體C3水平效果更為顯著（P＜0.05），外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論 復(fù)方竹葉石膏顆粒對(duì)急性放射性食管損傷家兔的免疫功能具有顯著修復(fù)作用。

急性放射性食管炎（RE） 復(fù)方竹葉石膏顆粒 免疫功能

肺癌、食管癌、縱隔腫瘤等頸胸部惡性腫瘤患者放射治療后，與放療前相比CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgG及補(bǔ)體C3數(shù)值下降［1-2］，造成患者機(jī)體免疫功能低下，常常誘發(fā)急性放射性食管損傷［3］，加之惡性腫瘤患者本身就常伴有機(jī)體免疫功能異常的表現(xiàn)［4］，同時(shí)免疫功能低下也可能是放射性食管炎遷延難愈的一個(gè)相關(guān)因素。復(fù)方竹葉石膏顆粒［5-6］由經(jīng)方竹葉石膏湯加味而來(lái)，是治療急性放射性食管損傷效果較為顯著的中藥制劑，但其在免疫功能方面的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立急性放射性食管損傷家兔模型，以臨床上治療急性放射性食管炎效果較為顯著的康復(fù)新液［7-8］作為陽(yáng)性對(duì)照藥，從家兔血清CD4+、CD8+、IgG及補(bǔ)體C3的變化探討復(fù)方竹葉石膏顆粒對(duì)急性放射性食管炎的免疫調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中國(guó)家兔40只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量（2.0±0.1）kg，購(gòu)自解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2015-0005］。溫度20～22℃；濕度50%～65%；通風(fēng)控制在 3.2 m2/h；噪音控制在60 dB以下。

1.2 試藥與儀器 1）實(shí)驗(yàn)藥品:復(fù)方竹葉石膏顆粒［5，8］由經(jīng)方竹葉石膏湯（竹葉15 g，生石膏30 g，太子參5 g，麥冬30 g，法半夏15 g，生甘草6 g）加入生薏苡仁30 g，莪術(shù)15 g，冬凌草15 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮15 g共11味藥組成，原顆粒制劑為12 g/袋（北京東升制藥廠，批號(hào)20160111）。本實(shí)驗(yàn)藥物按原方劑量配伍比例采用傳統(tǒng)煎藥法煎取藥液，以恒溫水浴鍋濃縮成含生藥2.0 g/mL的浸膏，分裝滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)成人（70 kg）臨床用量，按家兔等效劑量折算系數(shù)3.27換算給家兔。康復(fù)新液 （100 mL/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021834，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司）；3%戊巴比妥鈉所有藥品均購(gòu)買于解放軍總醫(yī)院。2）實(shí)驗(yàn)試劑:Anti-Rabbit CD4 FITC（型號(hào)MRB4035，美國(guó)Antigenix公司）；Anti-Rabbit CD8 FITC（型號(hào)MRB803，美國(guó)Antigenix公司）；免疫球蛋白IgG和補(bǔ)體C3試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司。3）實(shí)驗(yàn)儀器:直線加速器（Synergy，6MV能量，劑量率550 mu，瑞典醫(yī)科達(dá)公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)BDLSRII，美國(guó)B-D公司）；標(biāo)儀（型號(hào)Denley Dragon Wellscan MK 3，芬蘭Thermo公司，分析軟件:Ascent software for Multiskan）；洗板機(jī)（型號(hào)Wellwash 4 MK2，芬蘭Thermo公司）；數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 （型號(hào)PYX-DHS，規(guī)格4002×500，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；離心機(jī)（型號(hào)TGL-168，編號(hào)11-07，上海安亭科學(xué)儀器廠）；漩渦混合器（型號(hào)XW-80A，上海青浦滬西儀器）。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 將40只中國(guó)家兔隨機(jī)分為4組，每組10只:即空白對(duì)照組，單純照射組（模型組），復(fù)方竹葉石膏顆粒組，康復(fù)新組。除空白對(duì)照組外，其余3組均進(jìn)行急性放射性食管損傷造模。3%戊巴比妥30 mg/kg耳緣靜脈注射，將家兔麻醉，用加固型熱塑性塑料固定膜將家兔固定于罩下，保證家兔身體中立位，仰臥在放射治療模擬機(jī)下對(duì)食管定位，以6-MV直線加速器一次照射32 Gy，源皮距為100 cm，照射野下界位于膈肌食管裂孔下，以食管為中心，包括部分胃，長(zhǎng)7 cm，寬3 cm。以6 mV-X直線加速器一次性照射32 Gy，時(shí)間為5 min 20 s。造模成功后，空白對(duì)照組及單純照射組:0.9%氯化鈉注射液5 mL/（kg·d）。復(fù)方竹葉石膏顆粒組予含生藥9.16 g/（kg·d）的復(fù)方竹葉石膏顆粒浸膏?？祻?fù)新液組予康復(fù)新液，含生藥量3.3 mL/（kg·d）。以上各組均于照射前1周給藥至照射結(jié)束后1周停藥，每日1次。各給藥組均用連接灌胃針的注射器通過(guò)開口器插入舌根部，緩慢注入藥物，讓家兔自行吞咽，每日1次，療程為14 d，即于照射前1周給藥至照射結(jié)束后1周停藥。

1.4 觀察指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法 各組均于照射完成后1周取血，肝素抗凝。各組均于照射完成后1周于家兔耳源靜脈處麻醉后取血，肝素抗凝，用于T淋巴細(xì)胞亞群分析及血液分析，急速注射1.5～2 mL/kg（50 mg/mL）戊巴比妥鈉處死，迅速取出家兔全長(zhǎng)食管留以實(shí)驗(yàn)使用。1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)家兔外周血淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞百分率，同時(shí)計(jì)算CD4+/CD8+:每樣本分別取100 μL至兩個(gè)流式管底部，分別加入CD4 FITC、CD8 FITC熒光標(biāo)記抗體10 μL，同時(shí)設(shè)置不加抗體的陰性對(duì)照管；混勻后室溫避光孵育20 min，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液工作液，室溫避光裂解紅細(xì)胞10min；放入離心機(jī)，300 g離心5 min棄上清；加入2 mL流式細(xì)胞染色液重懸細(xì)胞，混勻后放入離心機(jī)，300 g離心5 min棄上清；加入500 μL流式細(xì)胞染色液重懸，及時(shí)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。2）采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)量家兔血清中IgG及補(bǔ)體C3含量。分別用抗兔IgG和C3單抗包被于酶標(biāo)板上，經(jīng)過(guò)加樣洗板等步驟用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)IgG和C3含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SSPS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異采用完全隨機(jī)單因素方差分析 （One-way ANOVA），均數(shù)的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+的變化 見表1。與空白對(duì)照組相比，其余3組外周血淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+、CD4+/CD8+絕對(duì)值均下降（P＜0.05）；與單純照射組相比，復(fù)方竹葉石膏顆粒組和康復(fù)新液組CD4+、CD4+/CD8+數(shù)值升高 （P＜0.05），CD8+變化無(wú)明顯差異（P＞0.05）；復(fù)方竹葉石膏顆粒組和康復(fù)新液組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組照射完成后第7天各組家兔外周血中細(xì)胞免疫、外周血IgG與補(bǔ)體C3變化比較（±s）

表1 各組照射完成后第7天各組家兔外周血中細(xì)胞免疫、外周血IgG與補(bǔ)體C3變化比較（±s）

與空白對(duì)照比較，*P＜0.05；與單純照射組比較，△P＜0.05；與康復(fù)新組比較，·P＜0.05

組 別 n CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+IgG（g/L） C3（g/L）空白對(duì)照組 10單純照射組 10康復(fù)新液組 10 35.35±3.57 20.97±3.33 1.72±0.31 18.79±2.18*17.75±1.84*1.06±0.15*26.47±1.14*△15.67±1.85*1.70±0.15△1.93±0.18 0.47±0.14 1.17±0.24*0.23±0.04*1.58±0.08*△0.31±0.07*△復(fù)方竹葉石膏組 1026.96±1.75*△16.35±1.84*1.66±0.14△1.76±0.14*△·0.39±0.11*△·

2.2 各組家兔外周血IgG與補(bǔ)體C3的變化 見表2。與空白對(duì)照組相比，其余3組外周血IgG與補(bǔ)體C3絕對(duì)值均下降（P＜0.05）。與單純照射組比較，復(fù)方竹葉石膏組和康復(fù)新液組IgG與補(bǔ)體C3數(shù)值較高 （P＜0.05）；復(fù)方竹葉石膏組與康復(fù)新液組比較，復(fù)方竹葉石膏組IgG及補(bǔ)體C3水平較高（P＜0.05）。

3 討 論

急性放射性食管炎目前西醫(yī)多采用消化道黏膜保護(hù)劑與“三素一麻”類藥物進(jìn)行對(duì)癥治療［9］，雖然可部分緩解患者的痛苦，但不能降低該病發(fā)生率，且免疫抑制及菌群失調(diào)等副作用明顯［10］。中醫(yī)藥在防治急性放射性食管炎時(shí)表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，急性放射性食管炎中醫(yī)學(xué)里多歸屬于“噎嗝”范疇，目前文獻(xiàn)報(bào)道多為自擬湯劑如血府逐瘀湯［11］、芍根湯［12］、沙參麥冬湯［13］等。中成藥方面報(bào)道較多的是康復(fù)新液，其成分主要為美洲大蠊蟲。吳少兵等報(bào)道康復(fù)新液顯著推后RE的發(fā)生時(shí)間，縮短持續(xù)時(shí)間，降低急性放射性食管炎級(jí)別［8］。周瓊等報(bào)道其提高了小鼠外周血CD4+/CD8+比值，具有增強(qiáng)免疫的功效；還同時(shí)具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、促進(jìn)組織修復(fù)等作用［14-15］。因此筆者選用康復(fù)新液作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。

筆者通過(guò)長(zhǎng)期臨床觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)急性放射性食管炎患者表現(xiàn)為口干咽干、吞咽疼痛、惡心嘔吐，舌紅少苔，脈細(xì)數(shù)，總結(jié)其病機(jī)為“熱毒侵襲，氣陰兩傷，胃失和降”［6，16］。復(fù)方竹葉石膏顆粒在原方基礎(chǔ)上加入白花蛇草、半枝蓮、生薏苡仁等5味藥，使其益氣養(yǎng)陰的同時(shí)兼?zhèn)淝鍩峤舛?、燥濕和胃的功效，正切中急性放射性食管炎熱毒侵襲的中醫(yī)病機(jī)。筆者前期研究表明經(jīng)方竹葉石膏湯加味防治本病能顯著降低急性放射性食管炎發(fā)生率，推后急性放射性食管炎發(fā)生時(shí)間，縮短持續(xù)時(shí)間［6，16］，課題組進(jìn)行竹葉石膏湯全方與拆方治療急性放射性食管炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)復(fù)方竹葉石膏顆粒能明顯減輕急性放射性食管炎大鼠模型的病理?yè)p傷及炎性改變，改善飲食量及控制體質(zhì)量下降，且呈現(xiàn)良好的量效相關(guān)性［17-18］，表明本方防治放射性食管炎療效肯定，但其在免疫功能方面的影響尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)主要觀察復(fù)方竹葉石膏顆粒在防治急性放射性食管炎時(shí)對(duì)其免疫功能的影響。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群（Tregs）在惡性腫瘤患者接受放射治療時(shí)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用［1］，其主要包括CD4+與CD8+等，CD4+細(xì)胞又稱為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，CD8+又稱為抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。雖然淋巴細(xì)胞對(duì)放射性非常敏感，但越來(lái)越多的報(bào)道顯示Tregs細(xì)胞是相對(duì)抗放射治療的，放療促進(jìn)腫瘤局部微環(huán)境中Tregs繁殖［19］，從而使外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)相對(duì)性降低。腫瘤局部增多的Tregs通過(guò)分泌IL_10、TGF-β等免疫抑制因子［20］和使抗凋亡蛋白下調(diào)（如Bcl-2蛋白）與促凋亡蛋白（Bax蛋白）上調(diào)等機(jī)制造成機(jī)體免疫功能異常等，其結(jié)果導(dǎo)致降低了惡性腫瘤患者放射治療的有效率，并且誘發(fā)了急性放射性食管炎等并發(fā)癥的產(chǎn)生［3］，因此，提高機(jī)體外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值變的尤為重要。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性放射性食管炎家兔的免疫功能明顯下降，與單純照射組相比，復(fù)方竹葉石膏顆粒組和KFX組經(jīng)預(yù)防性用藥后家兔外周血中CD4+百分率及CD4+/CD8+比值升高，但CD8+變化無(wú)明顯差異，其原因可能為單純照射組家兔外周血中CD4+下降，而CD8+代償性相對(duì)升高。復(fù)方竹葉石膏顆粒組和KFX組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明復(fù)方竹葉石膏顆粒在改善細(xì)胞免疫功能方面同臨床效果顯著的康復(fù)新液［7-8，14］具有一致性。然而，復(fù)方竹葉石膏顆粒修復(fù)AR家兔細(xì)胞免疫功能方面的機(jī)制是否是通過(guò)抑制IL-10、TGF-β、Bcl-2等途徑尚有待進(jìn)一步研究。

血清免疫球蛋白（Ig）的測(cè)定是檢查體液免疫功能最常用的方法，IgG是血清中主要抗體成分，約占75%，具有抗菌、抗病毒等作用，在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用。C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分，在腫瘤的非特異性體液免疫中具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。放射線造成食管黏膜上皮細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致機(jī)體IgG及C3水平降低，可能發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純照射組急性放射性食管炎家兔外周血中IgG及補(bǔ)體C3水平明顯下降，復(fù)方竹葉石膏顆粒組和KFX組IgG、C3水平升高，尤以復(fù)方竹葉石膏顆粒組升高較為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明復(fù)方竹葉石膏顆粒可以通過(guò)加強(qiáng)體液免疫對(duì)抗放射線導(dǎo)致的食管損傷，其原因可能為方藥中所含藥物具有抗菌抗病毒等功效，從而提高家兔外周血中IgG及補(bǔ)體C3水平。

綜上所述，復(fù)方竹葉石膏顆粒是一種防治急性放射性食管損傷效果較為顯著的藥物，組方中包含多種具有抗炎、抗腫瘤、提高免疫力的單味中藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方竹葉石膏顆粒對(duì)急性放射性食管炎家兔具有免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)急性放射性食管炎家兔的細(xì)胞免疫及體液免疫功能，如提高外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD4+/CD8+、IgG及C3的值。放療患者應(yīng)用該制劑不僅可以防治放療引起的食管損傷的并發(fā)癥，還可以提高患者機(jī)體免疫力，提高放療對(duì)于癌癥治療的有效率。

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Im munostimulatory Effect of a Compound of Zhuye Shigao Oral Granule on Radiation-inducedEsophagitis

WANG Lijuan，LU Junzhang，LI Mingwei，et al. Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.

Objective:To study the immune repairing effect of a compound Zhuye Shigao Granule（CZYG）in treating rabbit radiation-induced esophageal injury.Methods:Forty rabbits，clean grade，male，were randomly divided into the blank control group，simple irradiation group（model group），CZYG group，and Kangfu Xinye group，irradiated with a linear accelerator of 6MV X ray at a dose of 32 Gy，except the blank control group，to establish the model of acute radiation-induced esophagitis（RE）.Each group was treated with different drugs and started from one week before the irradiation to one week after the completion of the irradiation，once a day.The percentage of CD4+and CD8+were detected by flow cytometry，and the content of IgG and complement C3 were detected by immune turbidity method.Results:The percentage of CD4+，CD8+，the value of CD4+/CD8+and the level of IgG and complement C3 decreased in the model group.The percentage of CD4+，CD8+，the value of CD4+/CD8+in the Peripheral Blood and the level of IgG and complement C3 were improved in the drug groups compared with model group（P＜0.05），and the level of IgG and complement C3 were more remarkable in the CZYG than Kangfu Xinye group（P＜0.05）.The comparison on the value of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in the Peripheral Blood had no statistical difference（P＞0.05）.Conclusion:This study suggests that CZYG is able to repair the impaired cellular and humoral immunity of rabbits with RE.

Radiation-induced esophagitis（RE）；Compound Zhuye Shigao Granule（CZYG）；Immune function

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1855-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.007

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81357553）

△（電子郵箱：lujunzhang@sina.com）

（2016-03-11）