韓 平馮 俊陳華文

（1.湖北省秭歸縣人民醫(yī)院，湖北 秭歸 443600；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

·研究報告·

丹參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的機制研究*

韓 平1馮 俊2△陳華文2

（1.湖北省秭歸縣人民醫(yī)院，湖北 秭歸 443600；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

目的 探索丹參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的機制。方法 選取32只SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組，每組8只。丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組分別于術(shù)前7 d開始給予20 mg/（kg·d）、40 mg/（kg·d）的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液腹腔注射。假手術(shù)組、缺血再灌注模型組均給予等量蒸餾水腹腔注射。采用結(jié)扎左前降支法建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。各組于造模后3 h剪取心臟組織，采用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，Western bolt法檢測p-Akt表達，免疫組化法檢測Mfn2表達。結(jié)果 與假手術(shù)組相比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Mfn2表達顯著升高，p-Akt表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比較，丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Mfn2表達顯著降低，p-Akt表達顯著升高（P＜0.05），并顯示出明顯劑量依賴性。結(jié)論 丹參酮ⅡA可有效抑制心肌缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞凋亡，抑制Mfn2表達是其可能的作用機制。

丹參酮ⅡA 缺血再灌注 心肌細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 線粒體融合素2

心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌缺血再灌注（I/R）后心功能不全及心律失常的主要因素［1］。線粒體融合素（Mfn2）及其產(chǎn)物具有負(fù)向調(diào)控磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路的作用，從而在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［2］。丹參酮ⅡA可通過激活PI3K/Akt信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡過程，從而發(fā)揮心肌保護、抗動脈粥樣硬化等作用［3］。但丹參酮ⅡA對Mfn2的調(diào)控作用尚未明確。針對上述問題，研究選取心肌缺血再灌注損傷模型大鼠為研究對象，觀察辛伐他汀對心肌凋亡及Mfn2表達的影響，探討丹參酮ⅡA抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機制，為臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（諾新康；上海第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字H31022558）；DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Mfn2抗體、p-Akt抗體、Akt抗體（美國Santa Cruz公司）；免疫組化試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；凋亡檢測試劑盒（TUNEL法，德國Roche公司）。

1.2 實驗動物 健康成年SD大鼠32只，雄性，SPF級，體質(zhì)量220～270 g，購于同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心（動物合格證號:SCXK鄂2009-0003）。

1.3 分組與造模 將受試大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組，即假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組，每組8只。丹參酮ⅡA 20 mg組、丹參酮ⅡA 40 mg組分別于術(shù)前7 d開始給予20 mg/（kg·d）、40 mg/（kg·d）的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液腹腔注射。假手術(shù)組、缺血再灌注模型組均給予等量蒸餾水腹腔注射。大鼠采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，采用小動物呼吸機鼻面罩輔助通氣，常規(guī)開胸，逐層分離胸膜、心包，于左心耳下緣、肺動脈圓錐水平縱軸上，以縫線穿圓形塑料套管結(jié)扎模型組、5 mg辛伐他汀組、10 mg辛伐他汀組大鼠左前降支并阻斷血流。血流阻斷成功標(biāo)準(zhǔn):1）遠(yuǎn)端心肌出現(xiàn)蒼白；2）心電圖標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)ST段出現(xiàn)弓背向上型抬高。阻斷成功30 min后，剪開空心塑管，恢復(fù)血流，之后逐層關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組開胸后于左前降支下穿線，但并不結(jié)扎。再灌注3 h后，常規(guī)取出心臟標(biāo)本。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡。上述心臟標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋后切片。采用TUNEL法對切片進行染色，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行，以細(xì)胞核染成棕黃色為陽性，每張切片于缺血再灌注損傷區(qū)域（假手術(shù)組于左室前壁區(qū)域）隨機選取5個視野，記錄陽性細(xì)胞數(shù)，并計算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），AI（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。2）Western bolt法檢測p-Akt表達。采用Western blot法檢測心肌組織中p-Akt蛋白表達。常規(guī)提取組織蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%封閉液4℃封閉4 h，TBS緩沖液漂洗3次，加入相應(yīng)一抗（抗p-Akt、抗Akt、抗α-actin）（1∶1000），4℃孵育過夜，TBS緩沖液漂洗3次，加入相應(yīng)二抗（1∶500），室溫孵育2 h，增強化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。3）免疫組化法檢測 Mfn2表達。上述心臟標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋后切片，采用免疫組化法檢測Mfn2表達。嚴(yán)格按試劑盒操作說明進行，每張切片于缺血再灌注損傷區(qū)域（假手術(shù)組于左室前壁區(qū)域）隨機選取5個視野，采用虛擬顯微鏡拍攝圖片，使用圖像分析軟件測定Mfn2表達平均吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差檢驗，兩兩間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較 見表1、圖1。TUNEL染色結(jié)果顯示，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃色。假手術(shù)組未見心肌細(xì)胞凋亡；與假手術(shù)組相比較，模型組心肌細(xì)胞AI顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比較，丹參酮ⅡA組心肌細(xì)胞AI顯著降低，且丹參酮ⅡA40mg組較丹參酮ⅡA 20 mg組變化更為顯著（P＜0.05）

圖1 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較（TUNEL染色，400倍）

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較（%，±s）

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較（%，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA 20 mg組比較，▲P＜0.05。下同。

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2.2 各組p-Akt蛋白表達水平比較 見表2，圖2。Western bolt檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，模型組心肌p-Akt蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比較，丹參酮ⅡA組心肌p-Akt蛋白表達顯著增高，且丹參酮ⅡA 40 mg組較丹參酮ⅡA 20 mg組變化更為顯著（P＜0.05）。

2.3 各組Mfn2蛋白表達水平比較 見表3，圖3。免疫組化檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，模型組心肌Mfn2蛋白表達顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比較，丹參酮ⅡA組心肌Mfn2蛋白表達顯著降低，且丹參酮ⅡA 40 mg組較丹參酮ⅡA 20 mg組變化更為顯著（P＜0.05）。

圖2 各組心肌p-Akt蛋白表達水平比較

表2 各組心肌p-Akt蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組心肌p-Akt蛋白表達水平比較（±s）

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圖3 各組心肌Mfn2蛋白表達水平比較（免疫組化，200倍）

表3 各組心肌Mfn2蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組心肌Mfn2蛋白表達水平比較（±s）

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3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷過程中的標(biāo)志性事件，其發(fā)生機制較為復(fù)雜，主要由缺血、缺氧及氧化應(yīng)激等多種因素激活促凋亡基因、調(diào)控相關(guān)信號通路引起［4］。Ras-PI3K/Akt信號通路作為關(guān)鍵路徑在促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)該信號通路相關(guān)基因表達，抑制心肌細(xì)胞凋亡，已成為預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的新方向［5］。

丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分之一，具有調(diào)節(jié)血脂、抗血栓及延緩動脈粥樣硬化等作用，并被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。近年來隨著研究的深入，丹參酮ⅡA的細(xì)胞保護作用也日益受到關(guān)注［6］。研究證實，丹參酮ⅡA可通過抑制甲羥戊酸合成，阻礙小三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白Ras異戊二烯化，調(diào)控Ras-PI3K/Akt信號通路及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進一氧化氮（NO）釋放，減少活性氧（ROS）生成，具有顯著的抗氧化、抗炎及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡的作用［7］。但丹參酮ⅡA對Mfn2信號通路上游信號分子的調(diào)控作用尚未完全明確。

Mfn2屬于線粒體外膜蛋白，是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞信號通路調(diào)控點［8］。周煒等研究顯示，血管平滑肌細(xì)胞中的Mfn2可通過線粒體途徑對原癌基因Ras起到直接負(fù)調(diào)控作用，從而阻滯Ras-PI3K/Akt信號通路，抑制Akt磷酸化，進而抑制包括Bcl-2在內(nèi)的促凋亡基因表達，促進包括Bax在內(nèi)的抑凋亡基因表達，提示Mfn2在Ras-PI3K/Akt上游信號通路中起著關(guān)鍵的促凋亡作用［9］。但Mfn2在缺血再灌注損傷后心肌凋亡中的調(diào)控作用尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，急性心肌缺血再灌注損傷后，大鼠心肌組織切片缺血再灌注損傷區(qū)域可見Mfn2呈現(xiàn)高表達，而p-Akt呈現(xiàn)低表達，同時該區(qū)域內(nèi)心肌細(xì)胞大量凋亡，提示心肌缺血再灌注損傷可能通過激活Mfn2表達，抑制Akt磷酸化，從而促進心肌細(xì)胞凋亡［10］。與模型組相比較，于術(shù)前采用丹參酮ⅡA進行干預(yù)，可顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡、下調(diào)Mfn2表達、上調(diào)p-Akt表達，且丹參酮ⅡA的調(diào)控作用呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，提示丹參酮IIA可能通過抑制促凋亡基因Mfn2表達，調(diào)控Ras-PI3K/Akt信號通路，進而達到抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用［11-15］。

綜上所述，Mfn2可能在心肌缺血再灌注損傷過程中起到促心肌細(xì)胞凋亡作用，而丹參酮ⅡA可通過抑制Mfn2表達，抑制心肌缺血再灌注損傷后的心肌細(xì)胞凋亡，從而實現(xiàn)其心肌保護作用。丹參酮ⅡA是否還通過其他信號分子或信號通路發(fā)揮心肌保護作用，仍有待進一步深入研究。

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The Effect of TanshinoneⅡA on Cardiomyocyte Apoptosis after Myocardial Ischemia/Reperfusion Injuryin Rats

HAN Ping，F(xiàn)ENG Jun，CHEN Huawen.Zigui People′s Hospital，Hubei，Zigui 443600，China.

Objective:To evaluate the effect of TanshinoneⅡA on cardiomyocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Methods:32 SD rats were randomly divided into sham-operation group，model group，20 mg TanshinoneⅡA group and 40mg TanshinoneⅡA group，8 rats in each group.The 20mg TanshinoneⅡA group and the 40mg TanshinoneⅡA group respectively were given 20 mg/（kg·d）and 40 mg/（kg·d）TanshinoneⅡA intraperitoneal injection 7d before the operation.The sham-operation group and the model group were given equivalent normal saline intraperitoneal injection.The myocardial ischemia/reperfusion injury model was induced by ligation of left anterior descending artery.In 3h after reperfusion，the hearts of each group rats were harvested.The cardiomyocyte apoptosis was detected by TUNEL method，the p-Akt expression was detected by western bolt，and the Mfn2 expression was detected by immunohistochemistry method.Results:Compared with the sham-operation group，the cardiomyocyte apoptosis index and Mfn2 expression of model group significantly increased，and the p-Akt expression significantly decreased（P＜0.05）.Compared with the model group，the cardiomyocyte apoptosis index and Mfn2 expression of the 20 mg TanshinoneⅡA group and the 40 mg TanshinoneⅡA group significantly decreased，and the p-Akt expression significantly increased（P＜0.05），and showed significantly dose-dependent manner（P＜0.05）.Conclusion:TanshinoneⅡA can inhibit the cardiomyocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury，and down-regulating the expression of Mfn2 may be its mechanism.

TanshinoneⅡA；Ischemia/reperfusion；Cardiomyocyte；Apoptosis；Mitofusin

·研究報告·

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1844-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.004

國家自然科學(xué)基金項目（81202825）

△（電子郵箱：andyterry555@163.com）

（2016-02-13）