沈林林，鄒文超，高芳鑾，詹家綏

（福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

采用多基因聯(lián)合方法鑒定福建長(zhǎng)樂(lè)和福清產(chǎn)區(qū)馬鈴薯Y病毒株系組成

沈林林，鄒文超，高芳鑾，詹家綏

（福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

【目的】馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是馬鈴薯生產(chǎn)上危害較為嚴(yán)重的病毒，也是制約馬鈴薯可持續(xù)發(fā)展的主要病毒之一。論文旨在開(kāi)發(fā)一套簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的PVY分子鑒定技術(shù)，并采用該技術(shù)及時(shí)查明福建省部分產(chǎn)區(qū)PVY病害的發(fā)生、分布及PVY株系組成?！痉椒ā坎捎肊LISA方法對(duì)采自福建省長(zhǎng)樂(lè)市、福清市馬鈴薯種植區(qū)疑似受PVY感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PVY P1、VPg和CP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)ELISA檢測(cè)后的陽(yáng)性樣品進(jìn)行基因擴(kuò)增、克隆，并將獲得的序列進(jìn)行核苷酸序列一致性、重組位點(diǎn)、基因型分布和系統(tǒng)發(fā)育分析?！窘Y(jié)果】ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，17份樣品中有13個(gè)樣品與PVY抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)，其他呈陰性反應(yīng)。13個(gè)陽(yáng)性樣品均能成功擴(kuò)增出3個(gè)與P1、VPg和CP基因預(yù)期大小一致的特異片段。BLAST比對(duì)分析顯示P1、VPg和CP基因與文獻(xiàn)報(bào)道的已知PVY分離物的核苷酸序列一致性分別為72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3個(gè)基因聯(lián)合序列分析顯示，F(xiàn)Q01分離物與PVYN-Wi株系的核苷酸序列一致性最高，F(xiàn)Q08分離物與PVYE株系的核苷酸序列一致性最高，CL01、CL02、CL05和CL13 4個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高，CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重組分析顯示，除CP基因外，長(zhǎng)樂(lè)市和福清市兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的PVY分離物的P1和VPg基因中均檢測(cè)到顯著的重組信號(hào)?；蛐徒y(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)樂(lè)產(chǎn)區(qū)的P1基因?yàn)镹型（60%）和N×O重組型（40%），VPg基因均為N×O重組型，而CP基因均為O型，而福清產(chǎn)區(qū)的P1基因?yàn)镹型（25%）和N×O重組型（75%），VPg基因?yàn)镹×O重組型（87.5%）和O型（12.5%），而CP基因除了一個(gè)分離物為N型外，其他均為O型。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示分離物FQ01與PVYN-Wi株系聚為一簇，F(xiàn)Q08與PVYE株系聚為一簇，CL01、CL02、CL05和CL13與PVYNTN-NW株系SYR-I型聚為一簇，CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12與PVYNTN-NW株系SYR-II型聚為一簇，表明在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上，分離物FQ01與PVYN-Wi株系最近，F(xiàn)Q08與PVYE株系最近，CL01、CL02、CL05和CL13與PVYNTN-NW株系SYR-I型最近，CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12與PVYNTN-NW株系SYR-II型最近?！窘Y(jié)論】PVY在福建省長(zhǎng)樂(lè)市、福清市馬鈴薯種植區(qū)普遍存在，重組株系已成為田間的主流株系，且PVYNTN-NW已成為優(yōu)勢(shì)重組株系。

馬鈴薯Y病毒；ELISA；多基因聯(lián)合序列；系統(tǒng)發(fā)育；重組株系

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是僅次于水稻和小麥的全球第三大糧食作物［1］，也是世界上種植較為廣泛的經(jīng)濟(jì)作物之一。中國(guó)是世界上馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)［2］，病毒病是制約馬鈴薯可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一，它不僅使得馬鈴薯大幅減產(chǎn)［3］，而且還嚴(yán)重影響種薯質(zhì)量［4］。其中，馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是分布最為廣泛且危害最為嚴(yán)重的病毒之一［5-6］。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定出PVY株系，有助于了解PVY的發(fā)生、分布情況及株系組成，可以為綜合防控研究提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】PVY是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的代表成員［7］，其基因組由正單鏈RNA分子組成，大小約10 kb，包含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），成熟后最終生成11個(gè)多功能蛋白［7-8］。其中，P1蛋白的編碼區(qū)位于PVY基因組的起始端，編碼絲氨基酸蛋白酶（P1 peptidase）。該蛋白酶與RNA結(jié)合活力密切有關(guān)，并且影響病毒在細(xì)胞之間的傳播［9］；VPg蛋白是一個(gè)無(wú)序的多功能蛋白，具有穩(wěn)定病毒基因組結(jié)構(gòu)的功能［10］；而CP蛋白在病毒RNA的衣殼過(guò)程中起著重要作用，且其序列具有高度的保守性，是檢測(cè)PVY常用的分子標(biāo)記之一［4，10］。根據(jù)基因組內(nèi)是否存在重組位點(diǎn)，PVY可以分為PVYC、PVYO、PVYN等非重組株系以及在PVYO和PVYN株系之間不同基因區(qū)段重組而成的PVYNTN、PVYN-Wi、PVYN:O等重組株系［11］。除此之外，還有一些不常見(jiàn)的株系，如PVYE［12-13］。其中，PVYN-Wi株系含有兩個(gè)重組位點(diǎn)，分別位于P1和HC-Pro/P3基因區(qū)域；而PVYNTN-NW株系是近年來(lái)在研究敘利亞和中國(guó)分離物中新發(fā)現(xiàn)的重組株系，具有明顯的PVYNTN和PVYN-Wi重組株系進(jìn)一步重組的特征，并且含有SYR-I和SYR-II型兩種基因組結(jié)構(gòu)［14-15］。目前，用于馬鈴薯病毒病檢測(cè)的方法有傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)法、電鏡觀察、血清學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)等，但單獨(dú)使用以上的任何一種方法均無(wú)法實(shí)現(xiàn)PVY株系的準(zhǔn)確鑒定，因此，實(shí)踐中需要綜合應(yīng)用多種方法進(jìn)行分析。近年來(lái)，聯(lián)合多基因系統(tǒng)發(fā)育被廣泛用于細(xì)菌、真菌等的鑒定［16-19］。在PVY株系鑒定中，楊慶東等通過(guò)P1和CP基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，可以將PVYN:O、PVYN-Wi、PVYO、PVYN和PVYNTN準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)，但卻無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)別PVYN:O與PVYNTN-NW（SYR-I 型）及PVYN-Wi與PVYNTN-NW（SYR-II 型）［20-21］。高芳鑾［22］通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析與性狀關(guān)聯(lián)分析，表明僅聯(lián)合P1、VPg和CP基因分析可以將PVY的常見(jiàn)株系區(qū)分開(kāi)來(lái)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】福建省具有獨(dú)特的地理氣候優(yōu)勢(shì)，屬于中國(guó)馬鈴薯南方冬作區(qū)。近年來(lái)，隨著國(guó)家馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實(shí)施，福建省種植馬鈴薯的面積正呈逐年上升的趨勢(shì)，在春糧作物中占有越來(lái)越重要的地位。為及時(shí)了解福建省PVY變異株系的分布情況，生產(chǎn)上迫切需要實(shí)現(xiàn)PVY的快速檢測(cè)并準(zhǔn)確鑒定出PVY株系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增、基因克隆獲得福建省長(zhǎng)樂(lè)市、福清市兩個(gè)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)PVY樣品的P1、VPg和CP 3個(gè)基因序列，結(jié)合序列特征，采用多基因聯(lián)合方法實(shí)現(xiàn)PVY株系的快速、準(zhǔn)確鑒定，為該病毒的流行、變異趨勢(shì)及有效防控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年在福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所完成。

1.1 毒源

2015年利用隨機(jī)采樣法在福建省長(zhǎng)樂(lè)市、福清市馬鈴薯種植區(qū)采集17份帶有重型花葉、葉脈壞死和垂葉條斑壞死癥狀等典型PVY癥狀的馬鈴薯病葉，將新鮮病葉分別放置在不同密封袋中并標(biāo)記采樣時(shí)間、地點(diǎn)及編號(hào)，置于-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.2 試劑

DNA聚合酶（TransTaq DNA Polymerase HiFi）、DNA Marker和連接載體試劑盒（pEASY-T5 Zero Cloning Kit）均購(gòu)自北京全式金（TransGen）公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司；植物總RNA提取試劑盒（RNAsimple Total RNA Kit）和DNA回收試劑盒（Gel Purification Kit）均購(gòu)自天根（TianGen）生化科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ReverTra Ace qPCR RT Kit）購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)

按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，先將待測(cè)樣品加入預(yù)包被抗體的酶標(biāo)板中，放置在4℃冰箱孵育過(guò)夜，接著用PBST洗滌，之后將酶標(biāo)抗體加入并對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)，在室溫下孵育2 h，再用PBST洗滌，再將底物（pNPP）加入以顯色，使用Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀讀取405 nm處的OD值，通過(guò)比較405 nm處的OD值并判斷陰性、陽(yáng)性。試驗(yàn)檢測(cè)了17份樣品，并且每份樣品做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)計(jì)了3組對(duì)照，分別為陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照。

1.4 RNA提取及基因克隆

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒（RNA Simple Total RNA）說(shuō)明書(shū)提取17份疑似受PVY感染的馬鈴薯葉片的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ReverTra Ace qPCR RT Kit）說(shuō)明書(shū)，使用引物oligo（dT）18進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)擴(kuò)增雙鏈PVY全基因組的cDNA。由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成3對(duì)簡(jiǎn)并引物，該引物序列分別為： P1-F（5′-CVATGGCAAYYTACAYGTCAAC-3′）和 P1-R（5′-AGGRTATCTCADYHGTGCCC-3′），KV-F（5′-TAATATTGGTGGAGAGAYTGCTTG-3′）和 KV-R（5′-GCTTCATGCTCYACYTCCTG-3′），CP-F（5′-GSAAAYGAYACAATYGATGC-3′）和 CP-R（5′-CACATGTTYTTVACTCCAAG-3′）［15］。利用合成的3對(duì)簡(jiǎn)并引物，分別對(duì)P1、VPg及CP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其預(yù)期的片段大小分別為915、737和803 bp。試驗(yàn)中PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2.5 μL 10×TransTaq HiFi Buffer II，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），正向引物和反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，0.25 μL TransTaq HiFi Polymerase（5 U·μL-1），1 μL cDNA和17.25 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：首先在94℃下預(yù)變性處理4 min，隨后在94℃下變性處理30 s，在53—55℃溫度下退火30 s（P1、VPg和CP基因的退火溫度分別為53、55和55℃），再在72℃下延伸若干分鐘（延伸時(shí)間按照1 min·kb-1計(jì)算），其中變性、退火和延伸這3個(gè)過(guò)程各進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下終延伸5 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物，加入到1 μL的6倍上樣緩沖液（6×DNA Loading Buffer），混勻后滴至1%瓊脂糖凝膠的泳道中，采用110 V電壓電泳30 min檢測(cè)PCR產(chǎn)物。檢測(cè)成功的PCR產(chǎn)物利用DNA回收試劑盒回收純化，根據(jù)連接載體試劑盒（pEASY-T5 Zero Cloning Kit）的說(shuō)明書(shū)，將回收產(chǎn)物與T5 Vector連接載體25℃連接15 min，連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，最后通過(guò)菌落的重組子鑒定得到陽(yáng)性克隆，并從陽(yáng)性克隆中隨機(jī)選擇3—6個(gè)送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析及重組檢測(cè)

利用DNAMAN 9（Lynnon BioSoft，Canada）軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接。通過(guò)NCBI上的BLASTn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在線(xiàn)工具分析序列一致性。使用重組分析軟件RDP4對(duì)可能的重組事件進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)Simplot 3.5分析潛在重組相似性作圖（Similarity plot）。以PVYN株系的Mont分離物（GenBank登錄號(hào)：AY884983）和PVYO株系的Oz分離物（GenBank登錄號(hào)：EF026074）為參考親本序列［23］。

1.6 多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中選擇32個(gè)其他已知株系的PVY分離物作為參考（表1）。建樹(shù)前，使用MEGA 5［24］中的MUSCLE算法［25］分別對(duì)建樹(shù)的P1、VPg和CP基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)后，應(yīng)用SequenceMatrix［26］進(jìn)行序列串聯(lián)，獲得的合并序列采用鄰接法（neighborjoining，NJ）重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，最后應(yīng)用自舉法（Bootstrap）重復(fù)抽樣1 000次以評(píng)估各分支節(jié)點(diǎn)的可靠性。

表1 本研究采用到的PVY參考分離物的名稱(chēng)、株系分類(lèi)及GenBank登錄號(hào)Table1 Name， accession number and classification of reference isolates downloaded from GenBank in this study

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)

在檢測(cè)的17份樣品中，共有13份樣品與PVY抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)，其余4份樣品均呈陰性反應(yīng)，檢出率為76.47%（表2），其中采自福建長(zhǎng)樂(lè)的樣本陽(yáng)性檢出率為83.33%，而采自福建福清的樣本陽(yáng)性檢出率略低，為72.73%，兩者相差10.60%。

2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增

利用簡(jiǎn)并引物P1-F/P1-R、KV-F/KV-R、CP-F/CPR擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物與預(yù)期的目的片段大小相一致，分別約為915、737和803 bp。福建長(zhǎng)樂(lè)和福清兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的13個(gè)分離物以及陽(yáng)性對(duì)照均可擴(kuò)增到目的片段，陰性（健康馬鈴薯葉片）和空白對(duì)照都未擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。

RT-PCR擴(kuò)增獲得的基因片段裁去冗余序列和載體序列后，經(jīng)DNAMAN、BLAST等分析，確定P1、VPg和CP基因編碼區(qū)大小分別825 bp（GenBank登錄號(hào)KX376914-KX376918、KX376921、KX376922、KX376925、KX376927-KX376931）、564 bp（GenBank登錄號(hào)KX376932-KX376936、KX376939、KX376940、KX376943、KX376945、KX376946-KX376949）和801 bp（GenBank登錄號(hào)KX376950-KX376954、KX376957、KX376958、KX376961、KX376963-KX376967）。

2.3 目的基因的序列特征

序列一致性分析顯示，福建13個(gè)PVY分離物的P1基因與8個(gè)參考株系的核苷酸序列一致性為72%— 99%（表3），其中分離物CL01、CL02、CL05、FQ08、FQ13與Oz的序列一致性最低，為72%—73%，與Wilga5、34/1、SYR-II-2-8的序列一致性最高，為88%—99%。而VPg和CP基因與8個(gè)PVY參考株系核苷酸序列一致性都比較高，分別為85%—99%和88%—99%（表3）。其中，VPg基因中分離物FQ01與Mont的核苷酸序列一致性最低，為85%，與Oz、PB209、Wilga5和HN2的序列一致性最高，為99%；CP基因中分離物FQ08與PB209、Wliga5、SYR-II-2-8、Oz、HN2的序列一致性最低，為88%—89%，與Mont、PB312、34/1的序列一致性最高，為93%—95%。結(jié)合3個(gè)基因的序列一致性分析結(jié)果表明，CL01、CL02、CL05和CL13 4個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高，CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高，而FQ01分離物與PVYN-Wi株系的核苷酸序列一致性最高，F(xiàn)Q08分離物與PVYE株系的核苷酸序列高度同源。

Simplot分析顯示，在長(zhǎng)樂(lè)、福清兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的PVY分離物中，除了CP基因未檢測(cè)到重組信號(hào)外，P1和VPg基因中均檢測(cè)到潛在的重組信號(hào)（圖1為FQ09分離物的Simplot分析圖），重組位點(diǎn)分別位于P1和VPg 基因區(qū)域內(nèi)的第291和第128核苷酸位置，表明這些分離物均為重組型。

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)樂(lè)產(chǎn)區(qū)的P1基因?yàn)镹型（60%）和N×O重組型（40%），VPg基因均為N×O重組型，CP基因均為O型；福清產(chǎn)區(qū)的P1基因?yàn)镹型（25%）和N×O重組型（75%），VPg基因?yàn)镹×O重組型（87.5%）和O型（12.5%），CP基因除了一個(gè)分離物為N型外，其他均為O型（表4）。

表2 17份疑似PVY感染的馬鈴薯葉片的ELISA檢測(cè)Table2 ELISA detection of the 17 potato leaves with PVY-alike symptoms sampled

表3 PVY福建分離物和GenBank下載參考分離物之間的P1（單元格中第一個(gè)數(shù)據(jù)）、VPg（單元格中第二個(gè)數(shù)據(jù)）和CP（單元格中第三個(gè)數(shù)據(jù)）基因序列一致性Table3 Nucleotide identity in the P1 （1st value in the cells）， VPg （2nd value in the cells） and CP （3rd value in the cells） sequences between PVY isolates from Fujian and reference isolates downloaded from GenBank （%）

圖1 PVY福建分離物重組位點(diǎn)檢測(cè)Fig. 1 Detection of recombination breakpoints in the PVY isolates from Fujian Province

表4 福建長(zhǎng)樂(lè)、福清產(chǎn)區(qū)PVY株系組成Table4 Strain composition of PVY isolates sampled from Changle and Fuqing of Fujian Province

2.4 多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析

使用 NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示，所有的PVY分離物共形成了11個(gè)簇，其中來(lái)自同一株系的分離物以較高的置信度相聚在一起，表明PVY具有顯著的株系特異性。本研究獲得的4個(gè)分離物CL01、CL02、CL05和FQ13與PVYNTN-NW株系SYR-I型的3個(gè)分離物以較高的自舉值（BP=97）聚為一簇，CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和FQ12 7個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-II型的3個(gè)分離物也以較高自舉值（BP=97）聚為一簇，但FQ01分離物與PVYN-Wi株系的3個(gè)分離物以較高的自舉值（BP=97）聚為一簇，F(xiàn)Q08分離物與PVYE株系的兩個(gè)分離物以較高的自舉值（BP=97）聚為一簇。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在進(jìn)化關(guān)系上CL01等4個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-I型最近，CL03等7個(gè)分離物與PVYNTN-NW株系SYR-II型最近，而FQ01分離物與 PVYN-Wi株系最近，F(xiàn)Q08分離物與PVYE株系最近。

3 討論

PVY可以由40種多種蚜蟲(chóng)頻繁傳播，從而加快了流行速度［10］。農(nóng)產(chǎn)品全球化銷(xiāo)售及其本身快速變異的特點(diǎn)，也增加了PVY準(zhǔn)確鑒定的難度。福建省是重要的南方馬鈴薯冬作區(qū)，鑒定并了解福建省PVY株系的分布情況和組成，對(duì)該省PVY防控和發(fā)展中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。ELISA是PVY檢測(cè)上最為常用的血清學(xué)方法之一，雖然可以快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)大量的疑似樣品，但靈敏度低于以核苷酸為基礎(chǔ)的PCR方法，因而對(duì)于PVY含量低的材料容易漏檢。例如，高芳鑾等［4］分別用ELISA分析了采自重慶的28份感染PVY的馬鈴薯葉片，陽(yáng)性檢出率僅為43%（12/28），而改用RT-PCR方法時(shí)，陽(yáng)性檢出率則是100%。本試驗(yàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)了17份疑似PVY樣品，其中4份樣品呈陰性反應(yīng)，并經(jīng)CP基因的PCR擴(kuò)增確定不含有PVY。17份樣品中有13份呈陽(yáng)性反應(yīng)，檢出率為76.47%，相比2011年福建長(zhǎng)樂(lè)和福建福清的PVY檢出率（75.00%）略高一些［4］，說(shuō)明PVY在福建省馬鈴薯主要種植生產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)樂(lè)和福清普遍發(fā)生，且發(fā)生頻率稍有提高。究其原因，可能歸因于福建省農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易發(fā)達(dá)，馬鈴薯種薯和產(chǎn)品的調(diào)運(yùn)，加快了PVY的傳播。

圖2 基于NJ法重建的PVY P1、VPg和CP聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree reconstructed from the concatenated sequences of P1， VPg and CP genes using neighbor-joining method

由于PVY株系分化現(xiàn)象明顯，傳統(tǒng)上普遍采用的以CP單一基因?yàn)榛A(chǔ)的分子分類(lèi)方法無(wú)法滿(mǎn)足PVY株系的快速、準(zhǔn)確鑒定需求。采用CP單基因系統(tǒng)發(fā)育分析，可以將PVYO外的其他株系很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，但無(wú)法正確識(shí)別PVYN:O、PVYN-Wi和PVYNTN-NW3種株系，因?yàn)樗鼈兊腃P基因都是O型。通過(guò)全基因組序列分析可以獲得不同分離物的株系結(jié)構(gòu)類(lèi)型［27］，但試驗(yàn)成本較高，且實(shí)用性較差［28］。而多基因聯(lián)合分析彌補(bǔ)了這些不足，為準(zhǔn)確、快速地鑒定PVY常見(jiàn)株系提供了可能。在PVY基因組中，P1、HC-pro、VPg和CP基因是重組熱點(diǎn)的區(qū)域［23］。為實(shí)現(xiàn)PVY的快速檢測(cè)和鑒定，高芳鑾［22］以這4個(gè)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用不同基因組合分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育與性狀關(guān)聯(lián)分析進(jìn)一步驗(yàn)證各種組合中代表分離物與株系的關(guān)聯(lián)系數(shù)及相關(guān)參數(shù)，結(jié)果表明聯(lián)合P1、VPg和CP 3個(gè)基因即可將PVY的常見(jiàn)株系區(qū)分開(kāi)。利用此聯(lián)合多基因方法，筆者實(shí)驗(yàn)室鑒定到PVY一株新的重組分離物GF_YL21［22，29］，表明該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PVY常見(jiàn)株系的準(zhǔn)確鑒定，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)新重組分離物的預(yù)判。本文對(duì)福建省馬鈴薯主栽區(qū)PVY分離物P1、VPg和CP基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并聯(lián)合PVY基因組重組熱點(diǎn)所在的3個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，表明PVY在福建省長(zhǎng)樂(lè)市、福清市兩個(gè)馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生，重組株系已成為田間的主流株系，且PVYNTN-NW是優(yōu)勢(shì)株系。梁五生等［30］通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)的PVY群體主要以PVYN株系為主，但高芳鑾等［4］通過(guò)對(duì)中國(guó)14個(gè)省PVY分離物的檢測(cè)鑒定，表明PVY在馬鈴薯主要種植區(qū)普遍發(fā)生的多為重組株系。導(dǎo)致兩種不同結(jié)論的可能原因主要在于PVY基因組中P1、HC-pro、CP等基因區(qū)段重組頻繁，僅通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)基因進(jìn)行分析，無(wú)法獲得PVY株系的準(zhǔn)確鑒定。本研究的多基因聯(lián)合分析結(jié)果顯示，重組株系已經(jīng)成為了田間的主流株系（100%），包括PVYNTN-NW株系SYR-I型、PVYNTN-NW株系SYR-II型、PVYN-Wi株系和PVYE，進(jìn)一步支持高芳鑾等的鑒定結(jié)果［4］。重組株系被認(rèn)為可能比非重組株系具有更強(qiáng)的致病力［11］，并已在世界各馬鈴薯種植區(qū)越來(lái)越流行，因此生產(chǎn)上需要密切關(guān)注這些重組株系的發(fā)展動(dòng)態(tài)。

4 結(jié)論

通過(guò)ELISA方法對(duì)采自福建省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的17份疑似PVY樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率平均為76.47%，表明PVY在福建省馬鈴薯長(zhǎng)樂(lè)市、福清市兩地普遍發(fā)生；通過(guò)P1、VPg和CP 3個(gè)基因的序列特征及聯(lián)合多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，表明PVY重組株系已成為田間的主流株系，尤其是PVYNTN-NW株系。

［1］ BIRCH P J， BRYAN G， FENTON B， GILROY E， HEIN I， JONES J，PRASHAR A， TAYLOR M， TORRANCE L， TOTH I. Crops that feed the world 8: Potato: are the trends of increased global production sustainable？ Food Security， 2012， 4（4）: 477-508.

［2］ 胡新喜， 何長(zhǎng)征， 熊興耀， 劉明月， 宋勇， 聶先舟. 馬鈴薯Y病毒研究進(jìn)展. 中國(guó)馬鈴薯， 2009， 23（5）: 293-300.

HU X X， HE C Z， XIONG X Y， LIU M Y， SONG Y， NIE X Z. Progress on Potato virus Y. Chinese Potato Journal， 2009， 23（5）: 293-300. （in Chinese）

［3］ WANG B， MA Y， ZHANG Z， WU Z， WU Y， WANG Q， LI M. Potato viruses in China. Crop Protection， 2011， 30（9）: 1117-1123.

［4］ 高芳鑾， 沈建國(guó)， 史鳳陽(yáng)， 方治國(guó)， 謝聯(lián)輝， 詹家綏. 中國(guó)馬鈴薯Y病毒的檢測(cè)及CP基因的分子變異. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（15）: 3125-3133.

GAO F L， SHEN J G， SHI F Y， FANG Z G， XIE L H， ZHAN J S. Detection and molecular variation of Potato virus Y CP gene in China. Scientia Agricultura Sinica， 2013， 46（15）: 3125-3133. （in Chinese）

［5］ WHITWORTH J L， NOLTE P， MCINTOSH C， DAVIDSON R. Effect of Potato virus Y on yield of three potato cultivars grown under different nitrogen levels. Plant Disease， 2006， 90（1）: 73-76.

［6］ AKANDA A K. Performance of seed potato produced from sprout cutting， stem cutting and conventional tuber against PVY and PLRV. Bangladesh Journal of Agricultural Research， 2010， 34（4）: 609-622.

［7］ KING A M， LEFKOWITZ E， ADAMS M J， CARSTENS E B. Virus Taxonomy， Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier Academic Press， 2011.

［8］ CHUNG B Y， MILLER W A， ATKINS J F， FIRTH A E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008，105（15）: 5897-5902.

［9］ ROHO?KOVá J， NAVRáTIL M. P1 peptidase-a mysterious protein of family Potyviridae. Journal of Biosciences， 2011， 36（1）: 189-200.

［10］ QUENOUILLE J， VASSILAKOS N， MOURY B. Potato virus Y: a major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity. Molecular Plant Pathology， 2013， 14（5）: 439-452.

［11］ 史鳳陽(yáng)， 高芳鑾， 沈建國(guó)， 常飛， 詹家綏. 馬鈴薯Y病毒福建分離物P1基因的分子變異和結(jié)構(gòu)特征. 遺傳， 2014， 36（7）: 713-722.

SHI F Y， GAO F L， SHEN J G， CHANG F， ZHAN J S. Sequence variation of P1 gene in Potato virus Y isolated from Fujian Province. Hereditas， 2014， 36（7）: 713-722. （in Chinese）

［12］ LORENZEN J， NOLTE P， MARTIN D， PASCHE J S， GUDMESTAD N C. NE-11 represents a new strain variant class of Potato virus Y.Archives of Virology， 2008， 153（3）: 517-525.

［13］ GALVINO-COSTA S B F， FIGUEIRA A D R， CAMARGOS V V，GERALDINO P S， HU X J， NIKOLAEVA O V， KERLAN V，KARASEV A V. A novel type of Potato virus Y recombinant genome，determined for the genetic strain PVYE. Plant Pathology， 2012， 61（2）: 388-398.

［14］ ALI M C， MAOKA T， NATSUAKI T， NATSUAKI K. PVYNTN-NW， a novel recombinant strain of Potato virus Y predominating in potato fields in Syria. Plant Pathology， 2010， 59（1）: 31-41.

［15］ 高芳鑾， 常飛， 沈建國(guó)， 謝聯(lián)輝， 詹家綏. PVYNTN-NW榆林分離物的全基因組序列測(cè)定與分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 48（2）: 270-279.

GAO F L， CHANG F， SHEN J G， XIE L H， ZHAN J S. Complete genome analysis of a PVYNTN-NWrecombinant isolate from Yulin of China. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（2）: 270-279. （in Chinese）

［16］ 賈廣成， 周增強(qiáng)， 侯琿， 王麗， 朱建蘭. 蘋(píng)果輪紋病菌的多基因聯(lián)合鑒定. 生物技術(shù)通報(bào)， 2013（7）: 161-166.

JIA G C， ZHOU Z Q， HOU H， WANG L， ZHU J L. Botryosphaeria dothidea of multiple genes joint identification. Biotechnology Bulletin，2013（7）: 161-166. （in Chinese）

［17］ 劉威， 葉乃興， 劉偉， 金珊， 連玲麗， 賴(lài)建東， 謝運(yùn)海. 茶樹(shù)炭疽菌的鑒定及致病力分析. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）， 2015，44（6）: 581-586.

LIU W， YE N X， LIU W， JIN S， LIAN L L， LAI J D， XIE Y N. Identification and pathogenic analysis of the pathogen causing tea plant （Camellia sinensis） anthracnose. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science Edition）， 2015， 44（6）: 581-586. （in Chinese）

［18］ 周明霞， 陳勇喆， 王輝， 陳智， 鄧樂(lè). 發(fā)光細(xì)菌PB-P3.9的鑒定與gyrB、luxA基因系統(tǒng)發(fā)育分析. 食品科學(xué)， 2011， 32（15）: 220-224.

ZHOU M X， CHENG Y Z， WANG H， CHEN Z， DENG L. Identification and phylogenetic analysis based on gyrB and luxA of photobacterium PB-P3.9. Food Science， 2011， 32（15）: 220-224. （in Chinese）

［19］ 李河， 周?chē)?guó)英， 徐建平， 朱丹雪. 一種油茶新炭疽病原的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2014， 41（5）: 602-607.

LI H， ZHOU G Y， XU J P， ZHU D X. Pathogen identification of a new anthracnose of Camellia oleifera in China based on multiple-gene phylogeny. Acta Phytophylacica Sinica， 2014， 41（5）: 602-607. （in Chinese）

［20］ 楊慶東， 吳興泉， 陳士華， 劉曉磊. PVY株系間的分子變異及分子鑒定方法. 中國(guó)馬鈴薯， 2011， 25（3）: 166-169.

YANG Q D， WU X Q， CHEN S H， LIU X L. Molecular variation and identification of Potato virus Y strains. Chinese Potato Journal， 2011，25（3）: 166-169. （in Chinese）

［21］ 劉洪義， 梁五生， 劉忠梅， 張洪祥， 楊立群. 黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系檢測(cè). 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 45（1）: 47-52.

LIU H Y， LIANG W S， LIU Z M， ZHANG H X， YANG L Q. Identification of Potato virus Y strains in infected potato plants from some places of Heilongjiang Province. Journal of Northeast Agricultural University， 2014， 45（1）: 47-52. （in Chinese）

［22］ 高芳鑾. 中國(guó)馬鈴薯Y病毒群體遺傳結(jié)構(gòu)及其分子進(jìn)化機(jī)制［D］.福州: 福建農(nóng)林大學(xué)， 2014.

GAO F L. Population genetic structure of Potato virus Y and its molecular evolutionary mechanisms［D］. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University， 2014. （in Chinese）

［23］ HU X， KARASEV A V， BROWN C J， LORENZEN J H. Sequence characteristics of Potato virus Y recombinants. The Journal of General Virology， 2009， 90（12）: 3033-3041.

［24］ TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， STECHER G， NEI M，KUMAR S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28（10）: 2731-2739.

［25］ EDGAR R C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research， 2004， 32（5）: 1792-1797.

［26］ VAIDYA G， LOHMAN D J， MEIER R. SequenceMatrix: concatenation software for the fast assembly of multi-gene datasets with character set and codon information. Cladistics， 2011， 27（2）: 171-180.

［27］ KARASEV A V， GRAY S M. Continuous and emerging challenges of Potato virus Y in potato. Annual Review of Phytopathology， 2013， 51: 571-586.

［28］ 韋茂春. 侵染煙草的四個(gè)馬鈴薯Y病毒分離物基因組序列比較分析［D］. 南寧: 廣西大學(xué)， 2011.

WEI M C. Comparative analysis of genome sequences of four isolates of Potato virus Y infecting tobacco［D］. Nanning: Guangxi University，2011. （in Chinese）

［29］ GAO F L， CHANG F， SHEN J G， SHI F Y， XIE L H， ZHAN J S. Complete genome analysis of a novel recombinant isolate of Potato virus Y from China. Archives of Virology， 2014， 159（12）: 3439-3442.

［30］ 梁五生， 溫雪瑋， 劉洪義， 劉忠梅. 馬鈴薯Y病毒株系分類(lèi)及中國(guó)大田馬鈴薯感染的馬鈴薯Y病毒株系譜研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015， 31（21）: 136-143.

LIANG W S， WEN X W， LIU H Y， LIU Z M. Progress of Potato virus Y strain classification and analysis of profile of Potato virus Y strains infecting potato in China. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2015，31（21）: 136-143. （in Chinese）

（責(zé)任編輯 岳梅）

Strain Composition of Potato virus Y in Fujian Province Detected with the Concatenated Sequence Approach

SHEN Lin-lin， ZOU Wen-chao， GAO Fang-luan， ZHAN Jia-sui
（Institute of Plant Virology， Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province，F(xiàn)uzhou 350002）

【Objective】Potato virus Y （PVY） is one of the most destructive pathogens constraining sustainable development ofpotato industry. The objective of this study is to develop a fast， easy-to use and accurate approach to timely detect PVY strains and apply the approach to investigate the occurrence， distribution and composition of PVY strains in Fujian Province. 【Method】ELISA method was used to confirm the presence of virus in the PVY-alike leaf samples randomly collected from Changle and Fuqing cities in Fujian Province. Three pairs of degenerate primers designed from the conserved regions of P1， VPg and CP genes in the reference PVY sequences downloaded from GenBank were used to amplify the positive samples by ELISA test. Nucleotide identity and recombination events between isolates from Fujian and strains downloaded from GenBank were evaluated and phylogenetic tree was reconstructed using concatenated sequences of the three genes. 【Result】ELISA confirmed that 13 out of the 17 samples collected from the two potato producing areas were infected with PVY. RT-PCR amplifications of all 13 ELISA-positive samples generated the expected sizes of fragments corresponding to the three genes. Individual gene analyses showed that P1， VPg and CP sequences in Fujian isolates shared 72%-99%， 85%-99% and 88%-99% nucleotide identity with the

trains， respectively. Concatenated sequence analysis showed that FQ01 and FQ08 isolates shared the highest sequence identity with PVYN-Wiand PVYE， respectively；CL01， CL02， CL05 and CL13 isolates shared the highest sequence identity with PVYNTN-NW（SYR-I）， whereas CL03， CL04， FQ02，F(xiàn)Q06， FQ09， FQ11 and CL12 shared the highest sequence identity with PVYNTN-NW（SYR-II）. Recombination signals were identified in P1 and VPg genes but not in CP of PVY， which isolated from Changle and Fuqing cities in Fujian Province. Further analyses showed that in Changle City， P1 gene was composed of two lineages， with 60% being N lineage and 40% being N×O lineage. All VPg genes were N×O lineage and all CP genes were classified as O lineage. Similarly in Fuqing City， P1 gene was consisted of two lineages， with 25% being N lineage and 75% being N×O lineage； 87.5% VPg genes were N×O lineage and 12.5% was O lineage； and all except one （which was classified as N lineage） CP genes were O lineage. Phylogenetic tree revealed that isolates CL01， CL02，CL05 and CL13 were grouped with PVYNTN-NW（SYR-I） and isolates CL03， CL04， FQ02， FQ06， FQ09， FQ11 and CL12 were clustered with the PVYNTN-NW（SYR-II）， whereas isolate FQ01 was grouped with PVYN-Wiand isolate FQ08 was clustered with the PVYE， respectively. These results indicated that evolutionarily， CL01， CL02， CL05 and CL13 are closer to PVYNTN-NW（SYR-I）；CL03， CL04， FQ02， FQ06， FQ09， FQ11 and CL12 are closer to PVYNTN-NW（SYR-II）， FQ01 is closer to PVYN-Wiand FQ08 is closer to PVYE， respectively. 【Conclusion】PVY occurs frequently in Changle and Fuqing cities in Fujian Province and recombinant strains，particularly PVYNTN-NWare dominant in the PVY isolates from the province.

Potato virus Y （PVY）； ELISA； concatenated sequence； phylogeny； recombinant strain

2016-06-23；接受日期：2016-08-25

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-10）

聯(lián)系方式：沈林林，E-mail：18649708815@163.com。鄒文超，E-mail：tsou2015@163.com。沈林林和鄒文超為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者高芳鑾，Tel：0591-83793031；E-mail：raindy@fafu.edu.cn。通信作者詹家綏，Tel：0591-83856973；E-mail：jiasui.zhan@fafu.edu.cn