蔣展沫，孫 杰，易 陽，閔 婷，王麗梅

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

酸橙酚類物質(zhì)的提取工藝?優(yōu)化及分布和抗氧化活性研究

蔣展沫，孫 杰，*易 陽，閔 婷，王麗梅

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

研究酸橙果實(shí)不同部位酚類物質(zhì)在含量及抗氧化貢獻(xiàn)上的差異。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立以多酚提取率為響應(yīng)值的四因素回歸模型，優(yōu)化酸橙果肉酚類物質(zhì)的提取工藝。提取測(cè)定酸橙不同部位酚類物質(zhì)含量，采用HPLC-MS法分析其酚類物質(zhì)組成，并評(píng)價(jià)其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力。酸橙果肉多酚提取最佳工藝參數(shù)為料液比1∶16（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)46%，pH值2.5，浸提溫度39℃，此條件下的多酚提取率達(dá)0.45%。酸橙中酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)存在，其中游離酚含量從大到小依次為橙肉＞橙皮＞橙籽，而游離黃酮含量從大到小依次為橙皮＞橙籽＞橙肉；酸橙的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力從大到小依次為橙肉＞橙皮＞橙籽。

酸橙；酚類物質(zhì)；提取；分布；抗氧化

酸橙（Citrus aurantium L.） 是蕓香科柑橘屬植物，屬于藥食同源水果，其幼果可用于干制加工中藥材枳實(shí)和枳殼，用于寬中下氣、消導(dǎo)積滯和祛痰燥濕等。酸橙幼果的活性成分及其生理功效在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域已引起廣泛關(guān)注，尤其是酚類化合物的抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)等功能活性［1］。然而，酸橙成熟果實(shí)的相關(guān)研究報(bào)道鮮見。酸橙果實(shí)成熟后，其氨基酸、糖類和維生素等營養(yǎng)成分含量均顯著增加，但仍存在較重的酸味和澀味，不宜直接食用和加工食品，僅少部分用于加工飼料、果汁和果醬等［2-3］。以酚類化合物為代表的天然活性成分提取開發(fā)是酸橙精深加工的重要途徑。

酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，富含該類活性物質(zhì)的植物資源發(fā)掘和篩選一直備受關(guān)注［4］。植物不同組織部位中酚類物質(zhì)在含量、組成和抗氧化活性等方面往往有所差異，其開發(fā)利用亦應(yīng)有所側(cè)重。酸橙果皮、果汁和種子中酚類化合物的含量及抗氧化活性雖各有報(bào)道，但不同部位之間的差異并不清楚。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化酸橙果肉中酚類化合物的提取工藝，進(jìn)一步提取分析酸橙不同部位中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的含量及抗氧化活性，以期為酸橙天然抗氧化活性成分的提取開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

成熟的黃皮酸橙，湖北省荊州市卷橋柑橘專業(yè)合作社提供，試驗(yàn)前分取果肉、果皮和種子，分別粉碎、勻漿后使用。

XFH-D型高速分散器、SB-5200DNT型超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；HR7633型飛利浦榨汁機(jī)，飛利浦家庭電器有限公司產(chǎn)品；TGLL-16A型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品；PHS-25型pH計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品。

沒食子酸（Gallic acid）、水溶性VE（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、蘆?。≧utin），東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；FeCl3，Na2CO3，AlCl3·6H2O，NaNO2和福林酚試劑等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 酸橙果肉多酚提取工藝優(yōu)化

1.2.1 工藝流程

稱取3.00±0.05 g果肉勻漿后置于一定體積的乙醇溶液中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min高速均質(zhì)處理2 min后，采用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至適當(dāng)pH值。料液置于控溫的120 W超聲場(chǎng)中持續(xù)浸提一定時(shí)間后，離心（4 000 r/min，10 min）、過濾分離濾液，定容至100 mL，混勻后待測(cè)。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

（1）料液比。在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，pH值4，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間20 min的條件下，考察不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）對(duì)多酚提取率的影響。

（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)。在料液比1∶15，pH值4，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間20 min的條件下，考察乙醇溶液不同體積分?jǐn)?shù)（0，20%，40%，60%，80%）對(duì)多酚提取率的影響。

（3）pH值。在料液比1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間20 min的條件下，考察不同pH值（2，3，4，5，6）對(duì)多酚提取率的影響。

（4）浸提溫度。在料液比1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，pH值4，浸提時(shí)間20 min的條件下，考察不同提取溫度（20，30，40，50，60℃）對(duì)多酚提取率的影響。

（5）浸提時(shí)間。在料液比1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，pH值4，浸提溫度50℃的條件下，考察不同浸提時(shí)間（5，10，20，40，60 min）對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)。

1.3 酸橙游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的提取

游離態(tài)酚類物質(zhì)的提取采用響應(yīng)面法優(yōu)化的酸橙多酚提取工藝。稱取3.00±0.05 g樣品置于48 mL的46%乙醇溶液中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min高速均質(zhì)處理2 min后調(diào)節(jié)pH值至2.5。料液于39℃下超聲浸提10 min后，經(jīng)離心、過濾分離濾液。濾渣加入48 mL的46%乙醇溶液并重復(fù)以上步驟提取2次，合并濾液。將濾液于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并用46%乙醇溶液定容至25 mL，置于-20℃保存待測(cè)。結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)方法提取，定容至10 mL后置于-20℃保存待測(cè)。提取制備重復(fù)平行3次。

1.4 分析方法

1.4.1 總酚和總黃酮測(cè)定

總酚和總黃酮的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［4］；多酚提取率（%）以濕基（WW）中所含沒食子當(dāng)量（GAE）的質(zhì)量百分比計(jì)；酸橙不同部位總酚含量以每100 g濕基中所含沒食子酸當(dāng)量表示（mg GAE/100 g WW），總黃酮含量以每100 g濕基中所含蘆丁當(dāng)量（RE）表示（mg RE/100 g WW）。

1.4.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)

DPPH自由基清除能力參考文獻(xiàn)［5］方法測(cè)定不同濃度（30，60，90 μg GAE/mL）樣液的DPPH自由基清除率；ABTS自由基清除能力采用文獻(xiàn)［4］方法測(cè)定不同濃度樣液的ABTS自由基清除效果；FRAP抗氧化能力采用文獻(xiàn)［4］方法測(cè)定不同濃度樣液的FRAP抗氧化作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析采用SAS（V8）軟件處理；采用IBM SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間0.05水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用S-N-K檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls test）。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各試驗(yàn)因素對(duì)酸橙果肉多酚提取率的影響

各試驗(yàn)因素對(duì)酸橙果肉多酚提取率的影響見圖1。

圖1 各試驗(yàn)因素對(duì)酸橙果肉多酚提取率的影響

由圖1（a）可知，多酚提取率隨料液比的減小而逐漸增大。料液比1∶15時(shí)的多酚提取率顯著高于1∶5和1∶10（p＜0.05），但隨著料液比的進(jìn)一步減小，多酚提取率并未顯著增加（p＞0.05）。由此，選擇酸橙多酚浸提的適宜料液比為1∶10～1∶20。

由圖1（b）可知，多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。酸橙果肉中酚類物質(zhì)可能具有相對(duì)較寬的極性分布，且大部分與20%～60%乙醇溶液的極性相當(dāng)，故在此體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的多酚提取率，各體積分?jǐn)?shù)之間并無顯著性差異（p＞0.05），但均顯著高于純水和80%乙醇的提取率（p＜0.05）。由此，選擇酸橙果肉多酚浸提的適宜乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為20%～60%。

由圖1（c）可知，隨著浸提液pH值的增加，酸橙果肉多酚提取率發(fā)生明顯下降。pH值為2時(shí)的多酚提取率最高（p＜0.05），而pH值介于3～5時(shí)多酚提取率無顯著差異（p＞0.05）。偏酸條件可能有利于組織中部分與多糖和蛋白以氫鍵和（或）疏水鍵結(jié)合的酚類物質(zhì)解離，故適宜的酸橙果肉多酚浸提pH值范圍為2～4。

由圖1（d）可知，酸橙多酚提取率隨浸提溫度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。浸提溫度40℃時(shí)的多酚提取率顯著高于20℃和60℃（p＜0.05），但與30℃和50℃的提取率無顯著差異（p＞0.05）。浸提溫度增加有利于酚類物質(zhì)溶出，但高溫可能導(dǎo)致酚類物質(zhì)的分解，故適宜的酸橙果肉多酚浸提溫度范圍為30～50℃。

由圖1（e）可知，在浸提時(shí)間5～60 min內(nèi)的多酚提取率并無顯著變化（p＞0.05），故選定酸橙果肉多酚浸提時(shí)間為5min。

2.2 酸橙果肉多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

以料液比X1，乙醇體積分?jǐn)?shù)X2，pH值X3，浸提溫度X4為試驗(yàn)因素，建立以酸橙果肉多酚提取率Y為考察指標(biāo)的回歸模型如下：

Y=0.437 9+0.003 6X1+0.006 3X2-0.007 4X3-

0.009 8X4-0.017 4X12+0.003 0X1X2-

0.007 7X1X3-0.000 1X1X4-0.016 2X22-0.005 4X2X3-0.002 4X2X4-0.010 6X32-0.004 9X3X4-0.033 7X42.

由表3可知，回歸達(dá)到極顯著水平（p＜0.000 1），考察指標(biāo)Y的決定系數(shù)R2值達(dá)94.68%，模型擬合較好。逐項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：線性項(xiàng)和平方項(xiàng)對(duì)Y值有極顯著影響（p＜0.001），而交互項(xiàng)對(duì)Y值影響不顯著（p＞0.05）；線性項(xiàng)中，X2，X3和X4均對(duì)Y值有極顯著影響（p＜0.01），而影響程度依次減弱；交互項(xiàng)中僅X1X3顯著影響Y值（p＜0.05）。

采用RSREG Procedure分析回歸模型得到極值點(diǎn)，各因素的編碼值分別為X1=0.235 6，X2=0.306 9，X3=-0.484 2，X4=-0.121 2，響應(yīng)值Y=0.441 7%。將各因素編碼轉(zhuǎn)化并取整得到酸橙果肉多酚提取的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶16，乙醇體積分?jǐn)?shù)46%，pH值2.5及浸提溫度39℃，在此條件下的提取率預(yù)測(cè)值為0.44%，而實(shí)際提取率為0.45%。

2.3 酸橙不同部位酚類物質(zhì)含量及組成

酸橙不同部位酚類物質(zhì)含量見圖2。

由圖2可知，酸橙不同部位的多酚和黃酮均以游離態(tài)為主，其中橙肉游離酚含量（519.73 mg GAE/100 g WW）顯著高于橙皮（p＜0.05），而橙籽中游離酚含量最低（120.28 mg GAE/100 g WW）；橙皮具有最高的游離黃酮含量（670.65 mg RE/100 g WW），而橙籽中游離黃酮含量顯著高于橙肉（p＜0.05）。

圖2 酸橙不同部位酚類物質(zhì)含量

2.4 酸橙不同部位的抗氧化能力比較

酸橙果實(shí)不同部位的抗氧化能力比較見表4。

表4 酸橙果實(shí)不同部位的抗氧化能力比較

由表4可知，酸橙不同部位的抗氧化能力以100 g濕基中所含的TE當(dāng)量表示。整體而言，酸橙各部位的抗氧化活性主要由其游離酚貢獻(xiàn)，各部位結(jié)合酚的DPPH和ABTS自由基清除能力及FRAP總抗氧化能力均顯著弱于游離酚（p＜0.05）。酸橙果肉的游離酚DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及FRAP總抗氧化能力均顯著強(qiáng)于橙皮（p＜0.05），而橙籽的抗氧化能力最弱（p＜0.05）。Garau M等人［3］研究發(fā)現(xiàn)，酸橙干燥幼果果皮的抗氧化能力顯著高于果肉。酸橙酚類物質(zhì)的自由基清除活性與電子貢獻(xiàn)能力有關(guān)，主要受B環(huán)羥基化和甲氧基化程度及位點(diǎn)影響，而鄰苯二酚B環(huán)可能是重要的抗氧化特征結(jié)構(gòu)，其幼果與成熟果實(shí)不同部位抗氧化能力強(qiáng)弱不同的物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步明晰。

3 結(jié)論

結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，以多酚提取率為指標(biāo)優(yōu)化酸橙果肉酚類物質(zhì)的提取工藝條件為料液比1∶16，乙醇體積分?jǐn)?shù)46%，pH值2.5及浸提溫度39℃。在此條件下，多酚的實(shí)際提取率為0.45%，與預(yù)測(cè)值的差異小于5%，回歸模型擬合程度較好。各因素影響酸橙果肉多酚提取率的主次順序?yàn)榻釡囟龋緋H值＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。酸橙果實(shí)中酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)形式存在，且不同部位的酚類物質(zhì)含量存在顯著差異，其中游離酚含量以橙肉＞橙皮＞橙籽，而游離黃酮含量主次順序?yàn)槌绕ぃ境茸眩境热狻３热饩哂邢鄬?duì)較高的抗氧化能力，在抗氧化功能產(chǎn)品開發(fā)方面前景良好。

［1］易陽，王宏勛，何靜仁.酸橙活性成分及其生理功效的研究進(jìn)展 ［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（16）：3 721-3 725.

［2］Ou M.Chinese-English manual of common-used in traditional Chinese medicine［M］.Hong Kong：Joint Publishing Co.，1989：348-349.

［3］Garau M，Carme，Simal Susana，et al.Effect of air-drying temperature on physico-chemical properties of dietary fibre and antioxidant capacity of orange（Citrus aurantium V.Canoneta） by-products［J］.Food Chemistry，2007，104（3）：1 014-1 024.

［4］李青，張名位，張瑞芬，等.5種秈稻品種谷殼中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性比較 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（6）：1 150-1 158.

［5］孫杰，陸雙雙，徐燕燕，等.蓮藕不同部位酚類物質(zhì)含量、組成及抗氧化活性比較 ［J］.武漢輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（2）：20-25.◇

Study on the Extraction Technology Distribution and Antioxidant Activity of Phenolic Compounds from Citrus aurantium L.

JIANG Zhanmo，SUN Jie，*YI Yang，MIN Ting，WANG Limei
（College of Food Science&Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023，China）

This work aims to investigate the differences in the content and antioxidant activity of phenolic compounds from various parts of mature Citrus aurantium L.fruits.Base on signal-factor experiment，the extraction yield of phenolic compounds is used as response value to establish a regression model with four factors.Phenolic compounds from various parts of fruit are extracted for content measurement.Their compositions are detected by HPLC-MS method，and then DPPH and ABTS free radical scavenging capacities and FRAP total antioxidant capacity are evaluated.The optimized parameters for extracting phenolic compounds from Citrus aurantium L.pulp are confirmed as follows：material to liquid is 1∶16（g∶mL），

Citrus aurantium L.；phenolic compound；extraction；distribution；antioxidant activity

TS255.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.010

2015-12-01

武漢輕工大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（2013RZ03）。

蔣展沫（1992— ），男，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。

*通訊作者：易 陽（1986— ），男，博士，副教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。

ethanol concentration is 46%，pH value is 2.5，and extraction temperature is 39℃.Under such conditions，the extraction yield of phenolic compounds reached to 0.45%.The phenolic compounds of the fruit mainly existed as free，the contents of free polyphenols in various parts are ordered as pulp＞peel＞seed，and the contents of free flavonoids are ordered as peel＞seed＞pulp.The antioxidant abilities of different parts，including DPPH and ABTS free radical scavenging capacities and FRAP total antioxidant capacity，could all be ordered as pulp＞peel＞seed.