黎 勇，尹海燕（山西康寶生物制品股份有限公司，山西長治 046000）

Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法驗證

黎 勇，尹海燕
（山西康寶生物制品股份有限公司，山西長治 046000）

試驗驗證了Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法，為后續(xù)試驗提供重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的檢測方法。以蛋白含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品，在100～0 μg/mL濃度范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99。標(biāo)準(zhǔn)曲線上至少6點（包含兩端）滿足準(zhǔn)確度介于95.2%～111.67%，標(biāo)準(zhǔn)曲線下限準(zhǔn)確度介于95.98%～103.6%。高、中、低質(zhì)量濃度（80，40，20 μg/mL）質(zhì)控樣本批內(nèi)精密度均介于1.51%～4.41%，批間精密度均介于3.83%～6.36%。綜合上述信息，Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法穩(wěn)定，可重現(xiàn)。重組人血清白蛋白-白細胞介素2在200～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均一。

lowry法；蛋白濃度；方法學(xué)驗證

本試驗驗證了Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法，為后續(xù)試驗提供重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的檢測方法?，F(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院購買，批號為270009-201106；供試品，重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白，批號為20140512，規(guī)格為0.2 mg/瓶。SIGMA-ALDRICH酚試劑；廣東西隴化工廠硫酸銅；國藥集團化學(xué)試劑有限公司碳酸鈉、酒石酸鉀；西隴化工股份有限公司氫氧化鈉。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣本

取蛋白含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水定量稀釋至每1 mL含1 mg，作為儲備液，即為每1 mL含1 000 μg的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。用純化水將1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液分別稀釋至100，80，60，40，20，10 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的Cal 1～Cal 6，以純化水作為Blank（空白對照孔）。

質(zhì)控樣本及最低定量限樣本：用純化水將供試品分別稀釋至80，40，20，10 μg/mL作為高、中、低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本及最低定量限樣本。

均一性樣本：將供試品用純化水分別稀釋至200，50，10 μg/mL作為高、中、低質(zhì)量濃度均一性樣本。

加標(biāo)回收率樣本：將供試品用純化水稀釋至20，40，60 μg/mL作為未加標(biāo)樣本；將供試品用純化水稀釋至20，40，60 μg/mL，并分別加入20 μg/mL的蛋白含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品作為加標(biāo)樣本。

1.3 試驗方法

精密量取一定體積的供試品置試管內(nèi)，加純化水至1 mL，加堿式碳酸銅溶液5 mL，搖勻，室溫放置10 min，快速加入酚試劑0.5 mL，搖勻，室溫放置30 min，顯色后，照紫外可見分光光度法，于波長650 nm處測定吸光度。精密量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL分別置于試管中，自“加水至1 mL”起，同法操作。準(zhǔn)確量取水1 mL，自“加堿式碳酸銅溶液5 mL”起，同法操作，作為空白對照。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)濃度對應(yīng)其吸光度，求直線回歸方程；將測得供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試品的蛋白質(zhì)含量。

2 方法驗證方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在100～0 μg/mL范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99。標(biāo)準(zhǔn)曲線上至少6點（包含兩端）滿足準(zhǔn)確度（實測值/理論值×100%）介于85%～115%，標(biāo)準(zhǔn)曲線下限附近準(zhǔn)確度介于80%～120%。

2.2 精密度與準(zhǔn)確度［1］

一條標(biāo)準(zhǔn)曲線、3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本（每個質(zhì)量濃度6個樣本）為一個分析批，測定3個分析批，每個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本至少5個滿足以下要求。

批內(nèi)精密度：要求質(zhì)控樣本CV不大于10%，在定量下限附近樣本的CV不大于15%。批間精密度：進行3批次試驗，要求每批次質(zhì)控樣本CV不大于10%，低濃度質(zhì)控樣本的CV不大于15%。

質(zhì)控樣本的準(zhǔn)確度介于85%～115%，低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本準(zhǔn)確度介于80%～120%。

2.3 定量下限［2］

以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低質(zhì)量濃度作為分析方法的定量下限?？疾?個樣本，要求至少5個樣本CV不大于15%，準(zhǔn)確度介于80%～120%。

2.4 均一性樣本

取高、中、低質(zhì)量濃度均一性樣本測定（高質(zhì)量濃度均一性樣本用純化水稀釋至50 μg/mL后測定，中、低質(zhì)量濃度均一性樣本直接測定），各考察6個樣本。測定結(jié)果的準(zhǔn)確度介于85%～115%（低質(zhì)量濃度樣本準(zhǔn)確度介于80%～120%），測定結(jié)果的CV在15%以內(nèi)視為樣本均一。

2.5 加標(biāo)回收率樣本

取加標(biāo)回收率樣本測定，未加標(biāo)樣本和加標(biāo)樣本各考察3個樣本，樣本測定結(jié)果的準(zhǔn)確度介于85%～115%視為滿足要求，加標(biāo)回收率介于80%～120%視為滿足要求［3-4］。

3 試驗結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在100～0 μg/mL范圍內(nèi)，以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y）、吸光度為橫坐標(biāo)（X）線性擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)（R2） 大于0.99。標(biāo)準(zhǔn)曲線上至少6點（包含兩端）滿足準(zhǔn)確度介于95.2%～111.67%，標(biāo)準(zhǔn)曲線下限準(zhǔn)確度介于95.98%～103.6%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線及準(zhǔn)確度的測定見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及準(zhǔn)確度的測定/μg·mL-1

3.2 精密度與準(zhǔn)確度

一條標(biāo)準(zhǔn)曲線、3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本（每個質(zhì)量濃度6個樣本）為一個分析批，測定3個分析批，每個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本滿足以下要求。

精密度：高、中、低質(zhì)量濃度（80，40，20μg/mL）質(zhì)控樣本批內(nèi)精密度均介于1.51%～4.41%，批間精密度均介于3.83%～6.36%。

準(zhǔn)確度：各質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本的準(zhǔn)確度均介于91.6%～114.38%。

精密度試驗結(jié)果見表2。

3.3 定量下限

以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低質(zhì)量濃度作為分析方法的定量下限，6個樣本CV為5.49%，準(zhǔn)確度介于95.98%～108.3%。

定量下限試驗結(jié)果見表3。

3.4 均一性樣本

重組人血清白蛋白-白細胞介素2各濃度均一性樣本的準(zhǔn)確度介于86.28%～113.97%，CV介于2.27%～10.16%。

均一性樣本試驗結(jié)果見表4。

3.5 加標(biāo)回收率樣本

未加標(biāo)樣本的準(zhǔn)確度介于89.23%～102.05%，加標(biāo)回收率介于84.73%～107.21%。

回收率試驗結(jié)果見表5。

表2 精密度試驗結(jié)果

表3 定量下限試驗結(jié)果

表4 均一性樣本試驗結(jié)果

3.6 影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗方案的異常情況

標(biāo)準(zhǔn)品保存條件為-20℃或以下溫度，實際保存溫度為-14.8～-33.9℃，超出規(guī)定溫度最長持續(xù)時間小于1.5 h。鑒于溫度偏差不大，持續(xù)時間不長，且后續(xù)檢測中標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定，故認(rèn)為該偏離對試驗結(jié)果無影響。

未見其他影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗方案的異常情況。

4 結(jié)論

Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法穩(wěn)定，可重現(xiàn)。重組人血清白蛋白-白細胞介素2在200～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均一。

The study on Methodology Validation of Recombinant Human Serum Albumin Interleukin 2 Fusion Protein by Lowry Method

LI Yong，YIN Haiyan
（Shanxi Kangbao Biological Products Co.，Ltd.，Changzhi，Shanxi 046000，China）

This test verifies the Lowry method which determines the content of recombinant fusion protein human serum albumin-interleukin 2，and provides a method that can determine the content of recombinant fusion protein human serum albumin-interleukin 2 for the following experiment.Methods:In the experiment of determination of protein content，national standard protein was measured as the standard，in the concentration range of 100～0 μg/mL we create a standard curve with good linear correlation and the coefficient（R2） is greater than 0.99.Results:The standard curve contains six points（both ends inclusive） at least and it can satisfy the accuracy ranged from 95.2%～111.67%，and the accuracy of the lower limit of the standard curve is between 95.98%～103.6%.The precisions of protein concentration（high，middle，low）of samples were between 1.51%～4.41%.The precisions between three batches were 3.83%～6.36%.The Lowry method for protein concentration of human serum albumin-interleukin 2 fusion is stable and repeatable.The data of protein concentration between 200～10 μg/mL were stable.

lowry method；protein concentration；method validation

R927.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.013

1671-9646（2016）10a-0042-03

2016-07-15

黎 勇（1982— ），男，本科，助理工程師，研究方向為生物制藥的發(fā)酵、純化、檢驗及檢驗的方法學(xué)驗證。