宋淑敏，魏連會，董 燕，劉宇峰（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

復(fù)合酶法制備漢麻籽多肽的工藝研究

宋淑敏，魏連會，董 燕，劉宇峰
（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)合酶解漢麻蛋白制備漢麻籽多肽，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗設(shè)計，以漢麻蛋白的水解度為考核指標，探討各酶解因素對水解度的影響，優(yōu)化復(fù)合酶水解蛋白的最佳工藝條件。試驗結(jié)果表明，復(fù)合酶最佳酶解條件為酶解溫度70℃，木瓜蛋白酶加酶量0.4%（底物質(zhì)量），中性蛋白酶加酶量3.0%（底物質(zhì)量），pH值5.0，料液比1∶5，酶解時間3 h。在該工藝條件下水解度為27.23%，與單一酶法相比，水解度明顯提高。關(guān)鍵詞：漢麻；復(fù)合酶；多肽

漢麻（Cannabis sativa L.）又稱大麻、火麻，是大麻科大麻屬一年生草本植物［1］。漢麻整個植株均可以開發(fā)利用，廣泛應(yīng)用于新材料、紡織、軍需裝備、制藥、食品等領(lǐng)域［2］。目前，許多國家都在大力開發(fā)和利用漢麻，尤其是以漢麻籽食品的開發(fā)備受人們關(guān)注。

漢麻籽主要是以加工油脂為主，油脂加工后的漢麻籽粕主要作為飼料處理，大大降低了漢麻籽利用率和附加值。漢麻籽具有較高的營養(yǎng)價值，漢麻全籽的蛋白質(zhì)含量一般為20%～25%，漢麻蛋白質(zhì)中含有21種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸［3］。大量研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)由于其分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，攝入人體后不易被消化吸收，從而影響了其生理功能和營養(yǎng)價值的有效發(fā)揮［4］。多肽具有原蛋白質(zhì)所不具備的良好溶解性、高穩(wěn)定性、高保濕性、抗凝膠性等［5］，還具有易吸收、降血糖、抗氧化［6］、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，因此多肽具有良好的開發(fā)前景［4］。

本研究采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)合酶解制備漢麻籽多肽，通過優(yōu)化復(fù)合酶酶解的工藝條件，以期提高漢麻蛋白水解度及多肽得率，為漢麻籽多肽在食品和藥品領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，對進一步提高漢麻籽深加工的附加值、促進漢麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

脫脂漢麻籽粕粉，由黑龍江省科學(xué)院大慶分院自制。脫殼漢麻籽經(jīng)超臨界CO2萃取油脂，再將脫脂的漢麻籽粕粉碎過60目篩備用。

木瓜蛋白酶（酶活力為8×105U/g）、中性蛋白酶（酶活力為1.3×105U/g），購自無錫雪梅酶制劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基本成分的測定［6］

蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法，脂肪含量的測定采用索氏抽提法，水分的測定采用常壓烘干法，灰分的測定采用高溫灼燒法。

1.2.2 水解度的測定［7］

采用福林酚比色法，按公式計算：

式中：N0——不同質(zhì)量濃度漢麻蛋白溶液氮含量，mg/mL；

N1——蛋白酶水解前可溶性氮含量，mg/mL；

N2——蛋白酶水解后可溶性氮含量，mg/mL。

1.2.3 工藝流程

漢麻籽粕粉→加水調(diào)整料液比→調(diào)節(jié)pH值和溫度→加蛋白酶→恒溫水浴搖床酶解→滅酶→酸沉→離心→取上清液→真空低溫冷凍干燥→多肽粉。

1.2.4 單一酶最佳酶解條件的優(yōu)化

中性蛋白酶各影響因素的單因素試驗，在單因素試驗的基礎(chǔ)上以水解度為指標，選擇酶解溫度、pH值、加酶量、料液比4個影響因素，采用L9（34）正交表進行正交試驗，對中性蛋白酶、木瓜蛋白酶最佳酶解條件進行優(yōu)化。

1.2.5 復(fù)合酶酶解條件的優(yōu)化

在中性蛋白酶、木瓜蛋白酶最佳酶解條件基礎(chǔ)上，以水解度為評價指標，選擇酶解溫度、pH值、加酶量為試驗因素，采用L9（34）正交表進行正交試驗，對中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)配的最佳酶解條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶的單因素試驗結(jié)果

主要研究酶解溫度、酶解時間、加酶量、pH值、料液比5個影響因素對中性蛋白酶酶解漢麻籽蛋白的影響。

酶解溫度對中性蛋白酶水解作用的影響見圖1。

圖1 酶解溫度對中性蛋白酶水解作用的影響

由圖1可知，中性蛋白酶在pH值7.0，料液比1∶10，加酶量2.0%，酶解時間3 h時，酶解溫度30～40℃，隨著酶解溫度的升高水解度（DH）也逐漸增大；酶解溫度超過40℃后，隨著酶解溫度的升高水解度降低，因此中性蛋白酶最佳酶解溫度為40℃。

酶解時間對中性蛋白酶水解作用的影響見圖2。

圖2 酶解時間對中性蛋白酶水解作用的影響

由圖2可知，在pH值7.0，料液比1∶10，加酶量2.0%，酶解溫度40℃時，酶解時間1～3 h，水解度上升的幅度最大；超過3 h，水解度下降，但下降的幅度減緩。因此最佳的酶解時間為3 h，此時水解度達到最大值。

加酶量對中性蛋白酶水解作用的影響見圖3。

圖3 加酶量對中性蛋白酶水解作用的影響

由圖3可知，pH值7.0，料液比1∶10，酶解溫度40℃，酶解時間3 h，水解度隨著加酶量的增加而上升；當(dāng)加酶量超過2.5%時，水解度略有降低。因此，加酶量以2.5%為最佳。

料液比對中性蛋白酶水解作用的影響見圖4。

圖4 料液比對中性蛋白酶水解作用的影響

由圖4可知，在pH值7.0，加酶量2.5%，酶解溫度40℃，酶解時間3 h時，料液比以1∶10為分界點，在1∶5～1∶10，隨著料液比的降低，水解度逐漸增大；在1∶10～1∶25，隨著料液比的降低，水解度逐漸降低。因此，最佳料液比為1∶10。

pH值對中性蛋白酶水解作用的影響見圖5。

圖5 pH值對中性蛋白酶水解作用的影響

由圖5可知，在料液比1∶10，加酶量2.5%，酶解溫度40℃，酶解時間3 h時，pH值在6.0～6.5，水解度上升的幅度非常大；pH值在6.5～8.0，隨著pH值的增加，水解度逐漸降低。因此，最佳pH值為6.5。

綜合以上單因素試驗結(jié)果，中性蛋白酶的最適水解條件為酶解溫度40℃，酶解時間3 h，pH值6.5，料液比1∶10，加酶量2.5%。

2.2 中性蛋白酶正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對中性蛋白酶酶解漢麻蛋白的各影響因子進行正交試驗，確定中性蛋白酶酶解的最佳條件，酶解時間為3 h。

中性蛋白酶正交試驗結(jié)果見表1。

表1 中性蛋白酶正交試驗結(jié)果

通過極差分析，影響中性蛋白酶水解度各因素的主次關(guān)系為A＞D＞C＞B，即酶解溫度對水解度的影響最大，是關(guān)鍵的影響因素，其次是料液比。得出最佳工藝條件為A3B1C3D1，即酶解溫度45℃，pH值6.0，加酶量3.0%，料液比1∶5。在該工藝條件下水解3 h，水解度為18.24%。

2.3 木瓜蛋白酶的正交試驗

通過木瓜蛋白酶單因素試驗（略）篩選出木瓜蛋白酶最佳的酶解條件為酶解溫度70℃，pH值5.0，加酶量0.4%，料液比1∶10，酶解時間1 h。為了確定在多因素條件下木瓜蛋白酶的最佳條件以及各因素對水解度影響的差異大小，以DH為評定指標，對木瓜蛋白酶的酶解溫度、pH值、加酶量、料液比4個主要因素采用L9（34）正交表進行正交試驗，酶解時間為1 h。

木瓜蛋白酶正交試驗結(jié)果見表2。

表2 木瓜蛋白酶正交試驗結(jié)果

由表2可知，最優(yōu)水平組合為A'2B'2C'2D'1，即酶解溫度70℃，pH值5.0，加酶量0.4%，料液比1∶5時，酶解效果最好。通過極差分析，各因素影響的主次順序為B'＞D'＞C'＞A'。通過對最優(yōu)組合A'2B'2C'2D'1驗證試驗，在酶解溫度70℃，pH值5.0，加酶量0.4%，料液比1∶5條件下酶解1 h，木瓜蛋白酶酶解漢麻蛋白的水解度為21.16%。

2.4 木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)配酶解條件的優(yōu)化根據(jù)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶最佳酶解條件，對

2種酶復(fù)配的pH值、酶解溫度、加酶量采用L9（34）正交表進行正交試驗，料液比1∶5，酶解時間3 h。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)配正交試驗結(jié)果見表3。

表3 木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)配正交試驗結(jié)果

由表3可知，影響漢麻蛋白水解度因素的主次關(guān)系為B''＞A''＞C''＞D''，酶解溫度對復(fù)合酶水解的影響最大，其次是pH值。最佳條件組合為A''1B''3C''2D''3，即酶解溫度70℃，pH值5.0，木瓜蛋白酶加酶量0.4%，中性蛋白酶加酶量3.0%。經(jīng)試驗驗證該工藝條件下的水解度為27.23%。

3 討論與結(jié)論

（1）通過木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配水解漢麻蛋白，經(jīng)正交試驗優(yōu)化后的酶解最佳條件為酶解溫度70℃，pH值5.0，木瓜蛋白酶加酶量0.4%，中性蛋白酶加酶量3.0%；最佳酶解條件下復(fù)合酶水解漢麻蛋白水解度為27.23%。

（2）研究表明，在單酶水解過程中木瓜蛋白酶水解效果要強于中性蛋白酶，但2種酶復(fù)合后有增效作用。采用復(fù)合酶法制備漢麻籽多肽的工藝，其水解度比利用單酶酶解的水解度有明顯提高。此外，采用雙酶同步水解，可以簡化酶解的操作程序，更易于工廠化生產(chǎn)。

［1］ 關(guān)鳳芝.大麻遺傳育種與栽培技術(shù) ［M］.哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010：57-69.

［2］ 許樹文，劉華．工業(yè)大麻的開發(fā)利用及其市場前景 ［J］.紡織導(dǎo)報，2005，27（7）：62-64．

［3］ 何錦鳳，張琨，陳天鵬.漢麻籽的營養(yǎng)成分和功能 ［J］.食品科技，2007（6）：258-259.

［4］ 孔令明，李芳，陶永霞，等.多肽的功能活性與研究進展 ［J］.中國食品添加劑，2009（3）：71-72.

［5］ 孫顯慧，蔣文強.大豆多肽的功能特性及其開發(fā)應(yīng)用［J］.糧食與油脂，2004（5）：7-10.

［6］ 侯曼玲．食品分析 ［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：273-285．

［7］ 趙新淮，馮志彪.大豆蛋白水解物水解度測定的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995（2）：178-181.◇

Double Enzyme Hydrolysis for Preparation of Cannabis Sativa L.Peptidesis

SONG Shumin，WEI Lianhui，DONG Yan，LIU Yufeng
（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to prepare peptides，papain and neutral protease is chosen to hydrolyze the protein of Cannabis sativa L. Firstly we use method of single-factor as basement to research and then comprehensively use the orthogonal experimental to find the most optimal starch hydrolysis process.By analyzing the degree of Cannabis sativa L，the best conditions of their enzymolysis are probed into.The result show that the most optimum hydrolysis technique is as follow：enzyme temperature is 70℃，pH value is 5.0，the amout of papain is 0.4%，the amount of neutral is 3.0%，the solid-liquid rate is 1∶5，enzymatic hydrolysis time is 3 horus.After improving the technological conditions，the final degree of complex hydrolysis are 27.23%.It is increased significantly compare with single enzymatic hydrolysis.

Cannabis sativa L.；complex enzyme；polypeptide

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.007

1671-9646（2016）10a-0022-03

2016-08-01

黑龍江省財政廳、黑龍江省科學(xué)院資助項目（20160101）。

宋淑敏（1968— ），女，本科，研究員級高級農(nóng)藝師，研究方向為植物生物技術(shù)。