關(guān) 琛，李志江，魏春紅，臧延青，王鶴霖，丁 潔（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

大孔樹脂分離純化豆醬中大豆苷元的研究

關(guān) 琛，*李志江，魏春紅，臧延青，王鶴霖，丁 潔
（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

以豆醬中游離異黃酮大豆苷元為研究對象，經(jīng)比較選擇AB-8型大孔樹脂進(jìn)行大豆苷元的分離純化。結(jié)果顯示，最佳動態(tài)吸附解析條件為上樣質(zhì)量濃度3 mg/mL，吸附速度2.0 mL/min，洗脫速度2.0 mL/min。在此條件下，大豆苷元的純度為71.50%。

大豆苷元；大孔樹脂；純化

0 引言

豆醬是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，以大豆作為主要原料［1］，味道醇厚、咸鮮適口，營養(yǎng)成分主要有大豆異黃酮、多肽、功能性低聚糖、蛋白黑素類、大豆皂苷等［2］。大豆異黃酮在預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、預(yù)防和緩解婦女更年期綜合癥等多方面都有較好的功效。

對大豆異黃酮的提取研究大多以總異黃酮為研究對象，而大豆苷元單體成分則具有更高的生物活性。通?？刹捎萌軇┹腿》ā⑽⒉ㄝo助萃取法、薄層層析和紙層析等進(jìn)行分離提?。浑S著分離技術(shù)的發(fā)展，運用高速逆流色譜法、超臨界CO2抗溶劑法、膜分離等新技術(shù)也取得了較好的效果［3-5］。

大孔吸附樹脂是一種弱極性聚合物吸附劑，其聚合單體為苯乙烯和丙酸酯，交聯(lián)劑為乙烯苯，致孔劑為甲苯、二甲苯［6］。因其操作簡便、成本低、易再生、除去干擾成分效果好［7-8］而被廣泛使用。

本文在前期試驗基礎(chǔ)上，以成品豆醬為原料，通過大孔樹脂分離純化大豆苷元，以探究豆醬功能性成分的組成及含量，為豆醬的綜合利用、研制富含大豆苷元的食品、開發(fā)保健品等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成品豆醬，黑龍江農(nóng)墾寶泉醬業(yè)提供；大豆苷元，購自Sigma公司，純度≥99%；AB-8，HPD-600，ADS-7和D101型大孔樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司提供；乙腈、二甲基亞砜、甲醇、乙醇，均為分析純；水為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

Z型玻璃層析柱（40 cm×2.0 cm），上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品；Agilent 1200型高效液相色譜儀，杭州天釗科技有限公司產(chǎn)品；HD-9797型電腦紫外檢測儀、HL-2D型定時數(shù)顯恒流泵，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附試驗

（1）靜態(tài)吸附率、解析率的測定。稱取預(yù)處理過的5 g濕樹脂、100 mL大豆苷元提取液置于錐形瓶中，25℃吸附24 h后，吸取上清液，測定大豆苷元酮的質(zhì)量濃度。計算大孔吸附樹脂對大豆苷元的吸附量Q和吸附率E。

式中：C0——吸附前大豆苷元質(zhì)量濃度，mg/mL；

C1——吸附后大豆苷元質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——溶液體積，mL；

W——大孔樹脂濕質(zhì)量，g。

濾去上清液后，用蒸餾水洗滌，待洗滌液呈無色透明時，加入100 mL 70%乙醇溶液（V/V），25℃下解析24 h后，吸取上清液，進(jìn)行大豆苷元質(zhì)量濃度的測定。

（2）靜態(tài)吸附、解析動力學(xué)曲線的測定。稱量5 g預(yù)處理的濕樹脂、100 mL的大豆苷元提取液置于錐形瓶中，于25℃吸附，每30 min取樣，測定大豆苷元的質(zhì)量濃度。

吸附后的樹脂濾出水洗后，加入100 mL 70%乙醇溶液（V/V），25℃搖床進(jìn)行振蕩，間隔20 min取樣，測定大豆苷元的質(zhì)量濃度。

（3）靜態(tài)吸附、解析條件的選擇。①吸附時間對靜態(tài)吸附效果的影響，稱取5 g預(yù)處理的濕樹脂、100 mL大豆苷元提取液置于錐形瓶中，25℃吸附12 h，每隔2 h吸取上清液，計算吸附率以確定最佳吸附時間。②洗脫時間對靜態(tài)吸附效果的影響，吸附后的樹脂濾出，水洗后置于錐形瓶中，加入100 mL 70%乙醇溶液（V/V），洗脫12 h，每隔2 h吸取上清液，計算吸附率以確定最佳洗脫時間。③乙醇體積分?jǐn)?shù)對靜態(tài)吸附效果的影響，將吸附后的樹脂濾出，水洗后置于錐形瓶中，分別加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液（V/V），洗脫12 h后，吸取上清液，計算吸附率以確定最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.2 大孔樹脂吸附的動態(tài)試驗

（1）吸附速度對動態(tài)吸附試驗結(jié)果的影響。樹脂預(yù)處理后裝入玻璃層析柱進(jìn)行淋洗，上樣質(zhì)量濃度為2 mg/mL，將提取液以1.0，2.0，3.0 mL/min的速度泵入。上樣后分步泵入40%，80%的乙醇溶液（V/V），洗脫速度為2.0 mL/min，根據(jù)圖譜選擇最佳吸附速度。

（2）洗脫速度對吸附動態(tài)試驗結(jié)果的影響。樹脂預(yù)處理后裝入玻璃層析柱進(jìn)行淋洗，上樣質(zhì)量濃度為2 mg/mL，以2.0 mL/min的速度泵入層析柱。上樣后分步泵入40%，80%的乙醇溶液（V/V），洗脫速度分別為1.0，2.0，3.0 mL/min，根據(jù)圖譜選擇最佳洗脫速度。

（3） 上樣質(zhì)量濃度對吸附動態(tài)試驗結(jié)果的影響。將預(yù)處理后的樹脂裝入玻璃層析柱后進(jìn)行淋洗，制備大豆苷元質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的提取液，吸附速度為2.0 mL/min。上樣后分步泵入40%，80%的乙醇溶液（V/V），洗脫速度為2.0 mL/min，根據(jù)圖譜選擇最佳上樣質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂吸附的靜態(tài)吸附試驗結(jié)果

2.1.1 樹脂的選擇

不同樹脂對大豆苷元的靜態(tài)吸附、解析效果見表1。

表1 不同樹脂對大豆苷元的靜態(tài)吸附、解析效果

AB-8和ADS-7型大孔樹脂對大豆苷元的吸附率較好；HPD-600和AB-8型大孔樹脂對大豆苷元的解析率較好；D101型大孔樹脂的吸附率和解析率都比較差。綜合靜態(tài)吸附、解析效果，試驗選擇AB-8，HPD-600和ADS-7型大孔樹脂分別進(jìn)行靜態(tài)吸附解析試驗，以確定純化大豆苷元最佳的樹脂材料。

2.1.2 3種大孔樹脂靜態(tài)吸附、解析條件的確定

（1）吸附時間對吸附效果的影響。吸附時間對吸附效果的影響見圖1。

圖1 吸附時間對吸附效果的影響

由圖1可知，AB-8，HPD-600型大孔樹脂對大豆苷元的吸附率達(dá)到最高需4 h，ADS-7型大孔樹脂需要8 h。AB-8和ADS-7型大孔樹脂對大豆苷元的吸附效果比HPD-600型大孔樹脂好。

（2）解析時間對解析效果的影響。

解析時間對解析效果的影響見圖2。

圖2 解析時間對解析效果的影響

由圖2可知，AB-8，HPD-600，ADS-7型解析率分別在2，3，5 h達(dá)到最高，AB-8和HPD-600型大孔樹脂解析率比ADS-7型大孔樹脂高。

（3）洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對吸附效果的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對解析效果的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解析效果的影響

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，可以將AB-8型大孔樹脂上吸附的大豆苷元解析完全，而ADS-7和HPD-600型大孔樹脂需要60%的乙醇。

綜上，AB-8型大孔樹脂的吸附量大、吸附快、解析率高，適合用于大豆苷元的分離純化。

2.2 AB-8型大孔樹脂的動態(tài)吸附試驗

2.2.1 吸附速度對動態(tài)吸附效果的影響

不同吸附速度的洗脫圖譜見圖4。

圖4 不同吸附速度的洗脫圖譜

由圖4可知，吸附速度為1.0，2.0，3.0 mL/min，對動態(tài)吸附效果影響不大。故在實際操作中，可以選擇與洗脫速度相同的吸附速度，不必再調(diào)節(jié)恒流泵。

2.2.2 洗脫速度對動態(tài)解析效果的影響

不同洗脫速度的洗脫圖譜見圖5。

圖5 不同洗脫速度的洗脫圖譜

由圖5可知，洗脫速度為2.0 mL/min時洗脫效果最好，有4個洗脫峰，40%與80%乙醇2個峰有較好的分離度；洗脫速度為1.0 mL/min時，洗脫峰均有拖尾，洗脫周期長且第2、第3洗脫峰重疊；洗脫速度為3.0 mL/min時，40%，80%乙醇洗脫2個峰的分離度均大幅下降。故選擇洗脫速度為2.0 mL/min。

2.2.3 上樣質(zhì)量濃度對動態(tài)吸附效果的影響

不同上樣質(zhì)量濃度的洗脫圖譜見圖6。

由圖6可知，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為1，2，3 mg/mL時均有4個洗脫峰；當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為1，2 mg/mL時洗脫峰的分離度比較好，但峰型不好，收集范圍不容易確定；當(dāng)上樣質(zhì)量濃度大于3 mg/mL時，洗脫峰重疊較多，分離效果較差。故選擇上樣質(zhì)量濃度為3 mg/mL。

圖6 不同上樣質(zhì)量濃度的洗脫圖譜

2.2.4 最佳動態(tài)吸附解析條件下的洗脫圖譜

最佳工藝的洗脫圖譜見圖7。

圖7 最佳工藝的洗脫圖譜

確定動態(tài)吸附解析條件為上樣質(zhì)量濃度3 mg/mL，吸附速度2.0 mL/min，洗脫速度2.0 mL/min。

2.3 純化后大豆苷元的純度

收集最佳工藝的洗脫液后進(jìn)行濃縮，測定濃縮液的體積，通過高效液相色譜測定大豆苷元含量，冷凍干燥后稱量。

式中：C——大豆苷元含量，mg/L；

V——濃縮液體積，L；

m——冷凍干燥后質(zhì)量，mg。

大豆苷元經(jīng)AB-8型大孔樹脂純化后純度為71.50%。

3 結(jié)論

通過比較AB-8，D101，ADS-7，HPD-600型大孔樹脂對大豆苷元的靜態(tài)吸附效果，選擇了吸附量較大、吸附速度較快、解析率較高的AB-8型大孔樹脂對大豆苷元進(jìn)行分離純化。確定最佳動態(tài)吸附解析條件為上樣質(zhì)量濃度3 mg/mL，吸附速度2.0 mL/min，洗脫速度2.0 mL/min，大豆苷元的純度為71.50%。

［1］ 包啟安.醬及醬油的起源及其生產(chǎn)技術(shù)（一） ［J］.中國調(diào)味品，1992（9）：3-6，25.

［2］ 范俊峰，李里特，張艷艷，等.傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品的生理功能 ［J］.食品科學(xué)，2005，26（1）：250-254.

［3］ 彭義交，劉宗林.大豆異黃酮雙向紙層析分析方法的研究 ［J］.食品科學(xué)，2004，25（4）：141-144.

［4］ 楊學(xué)東，鄧志成，王晶，等．反相高效液相色譜法制備純化大豆異黃酮糖苷 ［J］.色譜，2006，24（4）：363-366.

［5］ 曲麗萍，宓鶴鳴，范國榮，等.高速逆流色譜法分離制備淡豆豉中大豆素和染料木黃酮 ［J］.中草藥，2006，37（3）：375-377.

［6］ 李乃潔，周長民，劉然.合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)樣品雜質(zhì)純化的基本方法 ［J］.品牌與標(biāo)準(zhǔn)化，2011（24）：35-37.

［7］ 王如意，安日明.HP20大孔吸附樹脂對L-苯丙氨酸吸附條件的研究 ［J］.廣東化工，2011（6）：78-80.

［8］ 陳琛.白藜蘆醇提純技術(shù)研究進(jìn)展 ［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2011（3）：39-42.◇

Study on Purification of Daidzein from Soy Sauce by Macroporous Resin

GUAN Chen，*LI Zhijiang，WEI Chunhong，ZANG Yanqing，WANG Helin，DING Jie
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to free soy is oflavones daidzein as research object，using AB-8 resin to isolate and purify daidzein which extracted from soy sauce.The results show that AB-8 resin has a good isolation and purifying ability for daidzein.The optimum conditions are as follows：the concentration of loading sample is 3 mg/mL，the adsorption flow rate is 2.0 mL/min，the desorption flow rate is 2.0 mL/min.Under these conditions，the purity of daidzein is 71.50%.

daidzein；macroporousresin；purification

S816.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.004

1671-9646（2016）10a-0013-04

2016-08-22

大慶市指導(dǎo)性科技計劃項目（SZDFY201533）。

關(guān) ?。?983— ），女，碩士，講師，研究方向為發(fā)酵與釀造技術(shù)。

*通訊作者：李志江（1977— ），男，博士，副教授，研究方向為發(fā)酵與釀造。