王 翠，方先珍，劉曉麗，程 果

（河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008）

試驗研究

3種ELISA試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的比較

王 翠，方先珍，劉曉麗，程 果

（河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008）

為比較豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA試劑盒檢測效果，選擇LSI、IDE和LSY3種ELISA診斷試劑盒對90份豬血清樣品進行檢測。結(jié)果顯示LSI和IDE ELISA試劑盒更能真實地反應(yīng)豬群實際免疫情況，且LSI的檢測結(jié)果更為可靠；LSY ELISA試劑盒在實際使用中存在一定的不確定性。LSI ELISA試劑盒更適用于疫苗免疫抗體的檢測；IDE ELISA試劑盒更適用于檢測機體自然免疫產(chǎn)生的抗體和低日齡豬群免疫抗體。

血清學(xué)檢驗；PRRSV；ELISA試劑盒；包被抗原

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)損傷及免疫抑制和持續(xù)性感染的傳染性疾病。以母豬發(fā)熱、厭食、繁殖障礙，妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎，1周齡仔豬死亡率為40%～80%，1月齡時表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難，個別豬耳部和腹側(cè)皮膚呈一過性紫色，并且發(fā)育不良，運動障礙，免疫力嚴(yán)重降低，易繼發(fā)感染等為主要特征。

目前使用疫苗對豬群進行免疫是預(yù)防該病的主要方法。迄今國內(nèi)有多種方法可用于PRRSV血清抗體檢測。筆者選擇了3家基于ELISA方法建立的診斷試劑盒對90份豬血清樣品進行比對試驗，以期發(fā)現(xiàn)更好的診斷試劑盒用于臨床樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來自免疫背景清楚的規(guī)模養(yǎng)殖場，共計90份血清，其中育肥豬、仔豬、母豬各30份。

1.2 主要試劑與儀器

法國LSI公司豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒，以下簡稱為LSI；美國IDEXX公司PRRSX3 Ab試劑盒，以下簡稱為IDE；深圳市綠詩源生物科技有限公司PRRS（IgG）診斷試劑盒，以下簡稱為LSY。所用檢測試劑均在有效期內(nèi)。

酶標(biāo)儀，購自美國BIO-TEK公司，型號ELX-800；自動酶標(biāo)洗板機，購自美國BIO-TEK公司，型號ELX-50；恒溫箱，購自上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

試驗中使用到的試劑盒其方法均是間接ELISA，具體操作均嚴(yán)格按說明書所述進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

試驗中使用LSI、IDE、LSY 3種試劑盒對90份豬血清樣品進行檢測，其檢測結(jié)果均嚴(yán)格按使用說明書所述進行陰陽性判定，具體如表1。

2.2 3種試劑盒檢測結(jié)果值的相關(guān)性

檢測數(shù)據(jù)使用EXCEL處理，采用相關(guān)系數(shù)、符合率、Kappa統(tǒng)計量進行統(tǒng)計分析。

Kappa統(tǒng)計量的一致性強度按照參考文獻［1］的方法進行，Kappa值愈高表示一致性愈好。Kappa值＜0時，表明兩方法間一致性為極差；Kappa值在0.0～0.2范圍內(nèi)，一致性為微弱；Kappa值在0.21～0.40范圍內(nèi)，一致性為弱；Kappa值在0.41～0.6范圍內(nèi)，一致性為中度；Kappa值在0.61～0.80范圍內(nèi)，一致性為高度；Kappa值在0.81～1.00范圍內(nèi)，一致性為極強。

表1 3種試劑盒的檢測結(jié)果

對LSI、IDE、LSY 3種試劑盒的檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析，根據(jù)相關(guān)系數(shù)檢驗表查出，LSI與IDE試劑盒有極顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），LSY與LSI試劑盒的相關(guān)關(guān)系不顯著（P＞0.05），LSY與IDE試劑盒的相關(guān)關(guān)系顯著（0.01＜P＜0.05），具體相關(guān)系數(shù)如表2。

表2 3種試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)

2.3 3種試劑盒檢測結(jié)果的一致性

符合率指2種檢測結(jié)果定性同時為陽性或陰性樣本數(shù)之和除以檢測總數(shù)。IDE與LSI檢測結(jié)果符合率為57.78%（表3），其一致性強度為弱。這兩種試劑盒檢測結(jié)果中育肥豬的符合率為93.33%，仔豬的符合率為50%，母豬的符合率為30%。

表3 IDE與LSI檢測結(jié)果一致性分析

LSY與LSI檢測結(jié)果符合率為43.33%（表4），其一致性強度為微弱。這兩種試劑盒檢測結(jié)果中育肥豬的符合率為3.33%，仔豬的符合率為53.33%，母豬的符合率為73.33%。

表4 LSY與LSI檢測結(jié)果一致性分析

LSY與IDE檢測結(jié)果符合率為33.76%（表5），其一致性強度為極差，這兩種試劑盒檢測結(jié)果中育肥豬的符合率為10%，仔豬的符合率為96.67%，母豬的符合率為56.67%。

2.4 不同種群的抗體消長規(guī)律

3種檢測試劑盒對仔豬、育肥豬、母豬血清中抗體檢測結(jié)果見下圖，仔豬、育肥豬、母豬血清中檢測到的抗體陽性率基本呈遞增趨勢，對不同日齡群體的免疫程序能反映出其相關(guān)性，但不同試劑盒有差異，特別是LSY試劑盒的

表5 LSY與IDE檢測結(jié)果一致性分析

檢測結(jié)果與另外兩種試劑盒差異顯著。

圖 不同日齡種群免疫抗體陽性率檢測結(jié)果

3 討論

3.1 ELISA試劑盒抗原包被的差異

試驗中使用的3種ELISA試劑盒均是通過間接ELISA方法檢測豬血清中的PRRSV IgG抗體。其中試劑盒所包被的PRRSV抗原不同：LSI，IDE試劑盒以N核衣殼蛋白（N蛋白）作為主要的包被抗原，LSI試劑盒以膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作為主要包被抗原。

N蛋白是PRRSV病毒粒子中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒蛋白的20%～40%，是含有一個潛在的糖基化位點的磷酸化蛋白，作為主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，保守性高，具有群特異性，能夠同時用于檢測歐洲株和美洲株［2］。N蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)最強，機體產(chǎn)生的PRRSV抗體主要是針對N蛋白。此外，豬感染PRRSV 1 w后即可檢出N蛋白抗體，且N蛋白抗體維持時間較長。因此N蛋白可作為良好的診斷抗原來檢測PRRSV，也是最早用于試劑盒研究的蛋白。但是，N蛋白不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生病毒中和抗體，僅以N蛋白作為包被抗原的試劑無法反映機體的免疫狀態(tài)，不適合用于對疫苗免疫效果監(jiān)測。

M蛋白是ORF6編碼的非糖基化膜蛋白，也是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。其刺激機體引起的T細(xì)胞增殖反應(yīng)最強。Gp5是ORF5編碼囊膜糖蛋白，能誘導(dǎo)高滴度的中和性抗體，Gp2，Gp3，Gp4也各有相應(yīng)的生物學(xué)特性［3］，如參與細(xì)胞免疫和體液免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生主要的中和性抗體。因而，采用膜蛋白作抗原的診斷試劑盒不僅能檢測野毒感染狀況，而且能解決N蛋白作為抗原的診斷試劑盒無法反映機體免疫狀況的缺陷，有利于疫苗抗體水平的檢測。

因此，IDE試劑盒理論上適用于檢測機體自然免疫產(chǎn)生的抗體；LSI試劑盒更適用于疫苗抗體水平的檢測。

3.2 3種試劑盒檢測結(jié)果差異分析

通過對試驗結(jié)果的分析，筆者發(fā)現(xiàn)這3種ELISA檢測試劑盒中IDE與LSI的差異相對較小，而LSY不論是總體結(jié)果還是針對不同群體的檢測結(jié)果，均與IDE和LSI差異較大，而且與豬群的實際免疫情況亦不相符。究其原因，除了上述包被抗原的差異外，還可能與試劑盒生產(chǎn)過程中抗原的存儲、穩(wěn)定性以及顯色系統(tǒng)的穩(wěn)定性等具體制作工藝有關(guān)。

結(jié)合豬場的具體免疫情況（仔豬、育肥豬、母豬分別經(jīng)1次、2次、4次免疫）以及免疫抗體的消長規(guī)律［4］，筆者發(fā)現(xiàn)IDE和LSI2種試劑盒更能準(zhǔn)確和真實地反應(yīng)豬群的實際免疫情況，且LSI產(chǎn)品的檢測結(jié)果更為可靠，更適用于實際生產(chǎn)中疫苗抗體水平的檢測。同時綜合3種試劑盒的一致性結(jié)果可知，IDE試劑盒檢測低日齡豬抗體時與LSI結(jié)果符合率高，對母豬血清中的抗體水平檢測結(jié)果與LSI的符合率低，可能與母豬生長過程中PRRSV感染毒株和兩種試劑盒所包被抗原不同有關(guān)，因此在實際應(yīng)用中更適用于檢測低日齡豬群免疫抗體水平。4 結(jié)論

豬PRRSV ELISA檢測試劑盒在實際應(yīng)用過程中還應(yīng)該結(jié)合豬群的具體免疫背景、豬群日齡、健康狀況以及相應(yīng)的病原學(xué)檢測結(jié)果等，才能更好地為生產(chǎn)服務(wù)。

［1］夏邦世，吳金華.Kappa一致性檢驗在檢驗醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（1）：83-84.

［2］張林吉.豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白原核表達及抗體間接ELISA檢測方法的初步建立［D］.揚州大學(xué)大學(xué)碩士論文，2007.

［3］周婷.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及M蛋白基因克隆與序列分析［D］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2005.

［4］姚敬明，孟帆，吳忻，等.豬繁殖與呼吸綜合征母源抗體和免疫抗體的消長規(guī)律研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010（4）：205-209.

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1004-5090（2016）09-0008-03

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