李　華, 孫書洪, 亓樹艷, 孔令洪, 陳　波, 龍建綱, 孔　宇

(1. 西安交通大學 生物科學與技術學院, 陜西 西安　710049；2. 西安交通大學 南洋書院, 陜西 西安　710049)

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毛細管電泳技術在氨基酸分離教學實驗中的應用

李華1, 孫書洪1, 亓樹艷1, 孔令洪1, 陳波2, 龍建綱1, 孔宇1

(1. 西安交通大學 生物科學與技術學院, 陜西 西安710049；2. 西安交通大學 南洋書院, 陜西 西安710049)

在本科生物化學實驗課程中,原氨基酸分離實驗采用傳統(tǒng)的紙層析法分離,該方法存在耗時長、試劑毒性大、準確性差、斑點不清晰等缺點。針對傳統(tǒng)紙層析法的不足,應用毛細管電泳對氨基酸進行分離,并對影響分離效果的條件進行了優(yōu)化。改進后的實驗課程,在更安全有效分離氨基酸的基礎上,極大地提高了學生實驗的主動性和積極性。

毛細管電泳； 氨基酸； 生物化學實驗

在生物類專業(yè)本科的基礎課程“生物化學實驗”教學環(huán)節(jié)中引入交叉學科的新技術、新手段有利于學生及時了解、掌握學科的前沿,提高學生的學習興趣和實驗技能,并為后續(xù)的專業(yè)理論和實踐課程的開設打下良好的基礎[1-2]。

我校生命科學與技術學院開設的“生物化學實驗”是針對本校生物工程專業(yè)、生命科學基礎人才培養(yǎng)基地等專業(yè)學生開設的主干實驗課程,為專業(yè)基礎實驗課。實驗中根據(jù)生物理論課程的安排,對應地將實驗課程安排為糖類、脂肪、核酸、氨基酸、蛋白質、酶、酮體和維生素8個實驗模塊,共10個實驗。

在氨基酸實驗中,為配合學生在理論課程中學習的氨基酸性質相關知識點,開設了混合氨基酸的分離檢測這一實驗內容。在原先的教學計劃中采用傳統(tǒng)的紙層析分離,該分離方法存在耗時長、試劑毒性大(正丁醇、氨水等)、層析斑點有時存在不清晰或拖尾等缺點[3-5]。同時,學生在實驗過程中也反映,大量使用有機揮發(fā)類試劑讓有些學生出現(xiàn)頭暈、胸悶等不適癥狀,而且有的學生在高中實驗中做過紙層析色譜的類似實驗，因此設計了一種簡單、快速、試劑毒性低、準確性高的檢測方法[6-7]。

1　實驗部分

毛細管電泳(CE)是近些年發(fā)展迅速的一項微分離技術,具有高效、快速、靈敏、待測樣品用量少等優(yōu)點，因此,CE被廣泛地用于多個領域,例如,臨床醫(yī)學、手性物質分離、生物制藥、蛋白質分析等領域。實驗利用毛細管電泳儀-紫外檢測聯(lián)用手段,以常見的4種氨基酸[組氨酸(His),精氨酸(Arg),半胱氨酸(Cys),色氨酸(Trp)]為分離物,建立快速、準確分離分析氨基酸的儀器分析方法,使學生在快速分離氨基酸的過程中,學習和掌握毛細管電泳儀的工作原理和操作方法,拓展學生的思路[8-9]。

1.1儀器裝置與試劑

毛細管電泳儀系統(tǒng):Beckman-MDQ毛細管電泳系統(tǒng)(Beckman,Fullerton,CA,USA,帶紫外檢測器、自動進樣器和溫度控制器,儀器控制和數(shù)據(jù)分析軟件為Beckman 32 Karat 8.0)、熔硅毛細管(河北永年光纖廠)、pH計(MettlerTolrdo,PE30,USA)、離心機(Eppendorf AG,Eppendorf 5417R,Hamburg,Germany)、超純水儀(Millipore,Mili-Q,New Bedford,MA,USA)。

試劑：組氨酸、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸(阿拉丁,中國)；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸(中國醫(yī)藥集團總公司化學試劑有限公司)。

1.2溶液的配制

(1) 1.0 mmol/L組氨酸標準溶液的配置:精確稱取1.5 mg于15 mL離心管中,用移液器向離心管中加入10.0 mL 蒸餾水,渦旋混勻儀充分混勻,放入4 ℃保存,備用。

(2) 4.0 mmol/L精氨酸、4.0 mmol/L半胱氨酸、1.0 mmol/L色氨酸的標準溶液配制方法同上。

(3) 混合標準溶液的配制:將分別配制的1.0 mmol/L組氨酸、4.0 mmol/L精氨酸、4.0 mmol/L半胱氨酸各吸取500 μL和1.0 mmol/L,色氨酸標準溶液吸取250μL,加入2.0 mL試管中,渦旋混勻儀充分混勻,放入4.0 ℃保存,備用。

(4) 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液的配制:精確稱取4.0 g 氫氧化鈉,溶解于50 mL燒杯中,轉移至100 mL容量瓶,定容。

(5) 磷酸緩沖溶液配制:根據(jù)配制磷酸緩沖液的濃度分別計算二水合磷酸二氫鈉和十二水合磷酸氫二鈉的用量,并分別用50 mL燒杯溶解,再用100 mL容量瓶定容。再利用公式(1),計算2種溶液混合比例,使配置的磷酸緩沖溶液pH分別為5.0、6.0、7.0和8.0。

(1)

式中:pH,緩沖溶液pH；pKa,磷酸解離常數(shù)的負對數(shù)；Cb,磷酸二氫鈉在溶液中的濃度(mmol/L)；Ca,磷酸氫二鈉在溶液中的濃度(mol/L)。

1.3毛細管處理

(1) 截取一段已知長度的毛細管(48 cm×75 μm I.D,有效長度37 cm),在相應位置燒制長度1 mm左右的檢測窗口,小心裝入毛細管卡套中,固定好檢測窗口。首次使用的毛細管,用1.0 mol/L的氫氧化鈉沖洗10 min并放置過夜。隔天,用雙蒸水和電泳緩沖溶液各沖洗10 min(沖洗壓力20 p.s.i)。

(2) 在每2次運行之間分別用水、1.0 mmol/L氫氧化鈉、水、緩沖液各沖洗5 min,以保證峰型和保留時間具有良好的重現(xiàn)性。為了保證學生在實驗進行過程中有良好的操作性和簡便性,并且更加深入地了解毛細管電泳的工作原理,實驗中,選了經(jīng)典的毛細管電泳分離模式——毛細管區(qū)帶電泳對4種不同的氨基酸進行分離。

2　實驗結果與討論

傳統(tǒng)利用紙層析分離氨基酸的方法中,實驗結果不太理想,主要包括氨基酸層析斑點不清晰(甚至沒有層析斑點出現(xiàn))、色斑拖尾現(xiàn)象嚴重、實驗時間長。針對這些情況,采用毛細管電泳方法對4種氨基酸的分離進行了探索[10]。

2.1緩沖溶液pH對分離效果的影響

電泳緩沖溶液pH值是影響分離的一個重要因素,它通過影響電滲流、分析物質的帶電情況,最終影響分離度和分離效果。實驗中選用最常用的磷酸鹽緩沖溶液對pH值進行系統(tǒng)優(yōu)化,考慮到磷酸鹽緩沖液的最大緩沖能力在7.2附近,因此分別研究了pH為5.0、6.0、7.0和8.0時,4種氨基酸之間的分離度(resolution,Rs),并以Rs值為pH優(yōu)化的標準，見表1。

表1　不同pH條件下的Rs值

注:當pH值為5和6時,半胱氨酸和色氨酸峰型完全重合,因此無法計算半胱氨酸和色氨酸、組氨酸和色氨酸的Rs值。

從表1中可以得出:pH值在為5.0、6.0時,總有2種或3種不同的氨基酸無法得到分離。在pH值為7.0時,可以看到4種氨基酸都能夠得到較好的分離(Rs值均大于1.5,見圖1),而在pH值為8.0時,主要是組氨酸和色氨酸的分離度Rs小于1.5(Rs=1.28)。但從Rs值的角度可以看到,改變一些實驗條件,例如繼續(xù)提高pH值或是增加毛細管長度等,也能夠將4種氨基酸進行分離。這些實驗現(xiàn)象的分析能夠很好地培養(yǎng)學生的科學思維能力,體會完成一個實驗的方法并不是一成不變,進而讓學生的思維更加活躍。

圖1　4種混合氨基酸在pH 7條件下的電泳分離圖

在后續(xù)的實驗中,選擇pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液作為電泳緩沖液進行其他實驗條件的優(yōu)化。

2.2緩沖溶液濃度對分離效果的影響

電泳緩沖液濃度與雙電層厚度、電滲流大小、焦耳熱產(chǎn)生量及緩沖液黏度等因素有著密切的關系。因此本次實驗中對緩沖液濃度(20.0～ 60.0 mmol/L)進行了優(yōu)化。當緩沖溶液濃度較高時,緩沖溶液電阻較小,雙電層厚度較薄,電滲流較小,從而使分離的氨基酸在毛細管中的停留時間較長,有利于分離。當緩沖溶液濃度小于40.0 mmol/L時,4種氨基酸分離度較差(Rs<1.5)。然而當溶液濃度達到60.0 mmol/L時,4種氨基酸之間的Rs值會增加,但當分離電壓20.0 kV時,整個體系中的電流達到120.4 μA,電流較高會損傷儀器,縮短儀器壽命?？紤]到以上的因素,最終選擇了40.0 mmol/L為緩沖液的濃度。

2.3分離電壓和溫度對分離效果的影響

實驗中還探索了分離電壓和溫度對氨基酸分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)在低電壓情況下(15.0 kV)氨基酸遷移速度比較慢,色譜峰展寬比較嚴重,影響分離效果。因此,在電泳緩沖液濃度選擇為40.0 mmol/L的條件下,盡量提升分離電壓,分離電壓為20.0 kV的時候,4種氨基酸能夠得到較好的分離效果,同時,系統(tǒng)中的電流為68.5 μA,分離時間小于6 min。

實驗中將毛細管的溫度設定為20 ℃或25 ℃,發(fā)現(xiàn)溫度的改變對實驗結果基本上沒有影響。因此,只要在實驗中保證毛細管溫度在20 ℃左右即可。

綜上所述,優(yōu)化分離4種氨基酸實驗條件為:利用非涂層毛細管,有效長度37 cm；電泳緩沖液選取40.0 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)；以0.5 p.s.i壓力進樣0.5 s,分離電壓+20.0 kV。實際4種氨基酸的結果分離圖,如圖1所示。

3　實踐與成效

3.1提高學生的實驗積極性

利用毛細管電泳儀分離氨基酸,學生不僅能在課堂上親手操作大型儀器,同時還需要根據(jù)提供的氨基酸信息配制相應的緩沖溶液。學生根據(jù)實驗結果和學習到的相關知識,分析產(chǎn)生結果的原因,提出合理的優(yōu)化條件,在提出優(yōu)化條件后,再次進行實驗。與原方法相比,毛細管電泳方法極大地增強了課堂上學生的參與度和積極性,提高了對生物化學實驗的興趣。

3.2有利于高層次人才培養(yǎng)

學生在本科階段課程的學習中會接觸到許多大型儀器的知識,如毛細管電泳儀、氣象色譜、液相色譜等,但由于條件所限,通常的理論教學內容把重點放在了大型儀器的原理上,純數(shù)學的理論公式或大量的敘述僅讓學生從認知體系上了解儀器的特點,無法加深學生對課程所學知識的透徹理解,忽略了基本技能的培訓。在新的實驗過程中,學生首先需要將學習到的氨基酸基礎知識和毛細管的分離原理相結合,選擇出一個合適的緩沖溶液pH值,以達到4種不同氨基酸分離的效果,并且預測出4種氨基酸出峰順序,將預測結果和原因寫在隨堂實驗報告表上。隨后結合分析化學的知識,自己計算出2種磷酸鹽緩沖溶液的混合比例,配制相應pH值的緩沖溶液。因此,通過利用毛細管電泳分離檢測氨基酸,不僅能夠使學生更加深入理解氨基酸兩性化合物的性質和毛細管電泳儀內部結構、工作原理,而且能夠將書本上介紹儀器的基礎知識和實際應用很好地結合在一起[11]。

通過在本科階段讓學生簡單地操作一些大型分析類儀器,可以打破學生“進口儀器不敢使用”的心理障礙[12]。同時,大型儀器在本科教學中的使用,可以開闊學生的眼界,利于學生使用更多的大型儀器設備[13],例如氣、液相色譜,激光共聚焦掃描顯微鏡等。

4　結語

實驗中,系統(tǒng)優(yōu)化了緩沖溶液的pH值、濃度、分離電壓等重要條件,使整個分離實驗能夠在6 min內完成,實驗結果比較滿意。在本科實驗中利用毛細管電泳的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)紙層析分離實驗方法,不僅提高了分離效率、減少了有毒有害試劑的使用,同時,調動了學生的實驗積極性和主動性。與此同時,讓學生體會到實驗方法的選擇是多種多樣的,可以根據(jù)所學習的理論知識聯(lián)系實驗實際情況,逐漸摸索將方法不斷優(yōu)化,最終得到滿意的實驗結果。

References)

[1] 白長存,段巧玲,馬佳,等.生物化學實驗教學中學生科研思維的培養(yǎng)探討[J].基礎醫(yī)學教育,2014 (11):974-979.

[2] 李園園.生物化學實驗課程化的改革思考[J].生物技術世界,2015 (12):237.

[3] 張穩(wěn)嬋,弓巧娟,孫鴻,等.氨基酸混合物分離效果提高的實驗研究[J].化學教育,2013,34 (2):65-68.

[4] 陳剛,馬曉,楊玉珍.關于做好“紙層析法分離氨基酸”實驗的總結[J].生物學通報,2012,47 (10):43-44.

[5] 陳吉寶,劍振.紙層析法分離氨基酸實驗條件的優(yōu)化[J].南陽師范學院學報,2014,13 (12):28-31.

[6] 李尚偉,杜娟.基礎生物化學實驗教學改革探索[J].中國校外教育,2014 (29):109.

[7] 唐功,任朝琴,戴先芝,等.《生物化學實驗》教學改革與探索[J].實驗科學與技術,2014,12(1):73-75.

[8] 楊曉云,徐漢虹,王立世,等.色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的高效毛細管電泳分析[J].分析測試學報,2001,20 (3):15-18.

[9] 劉青青,賈麗.毛細管電泳技術在氨基酸分析中的研究進展[J].分析測試學報,2009,28 (1):123-128.

[10] Li H,Kong Y,Chang L,et al. Determination of Lipoic Acid in Biological Samples with Acetonitrile-Salt Stacking Method in CE[J].Chromatographia,2014,77 (1/2):145-150.

[11] 孔宇,張雅利,莫曉燕. 增強綜合開放實驗課程教學效果措施探索[J].實驗技術與管理,2014,31 (6):33-35.

[12] 晏井利,梅建平,黃海波,等.利用獨立操作提高大型儀器使用效益的探索與實踐[J]. 實驗技術與管理,2015,32 (11):273-279.

[13] 簡利茹.關于高校開設大型儀器培訓課程的思考[J].高校實驗室工作研究,2014 (4):88-89.

Study on separation of amino acids with capillary electrophoresis and its application in teaching experiment

Li Hua1, Sun Shuhong1, Qi Shuyan1, Kong Linghong1, Chen Bo2, Long Jiangang1, Kong Yu1

(1. School of Life Science and Technology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049, China;2. Nanyang College,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049, China)

In traditional biochemical experiments,amino acids were separated with paper chromatography,which possesses several disadvantages such as time-consuming,poisonous reagents,low sensitivity and so on. In view of the above shortcomings,the capillary zone electrophoresis method was applied for separation of amino acids. Separation conditions were also systematically optimized.The whole separation procedure was more safely and effectively with capillary electrophoresis. In addition,students’ enthusiasm and initiative were also enhanced.

capillary electrophoresis; amino acid; biochemical experiments

10.16791/j.cnki.sjg.2016.09.042

2016-03-14修改日期：2016-05-04

陜西省教改項目“生物工程專業(yè)貫通式創(chuàng)新人才培養(yǎng)實驗區(qū)建設”；西安交通大學教改項目“生物工程綜合開放實驗課程建設與實踐”

李華(1987—),男,山西夏縣,碩士,助理工程師,主要研究方向為生物工程專業(yè)教學與管理工作

E-mail：huali2014@mail.xjtu.edu.cn

孔宇(1976—),男,陜西南鄭,博士,副教授,主要研究方向為生物工程專業(yè)教學管理工作和綜合開放實驗教學工作.

E-mail：yukong@mail.xjtu.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2016)9-0163-03