陳　默, 王秋霞, 鄭　穎, 唐　玲, 周少霞, 付　鵬, 馬洪雨

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院, 江蘇 南京　210095)

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基于LC-MALDI的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立與評價

陳默, 王秋霞, 鄭穎, 唐玲, 周少霞, 付鵬, 馬洪雨

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院, 江蘇 南京210095)

建立了一套適用于LC-MALDI系統(tǒng)的標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù),主要包括蛋白提取、溶液內(nèi)酶解、肽段標記、液相分離、質(zhì)譜檢測、生物信息學(xué)分析等步驟。將該方法與傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳技術(shù)進行了比較與評價,該方法的實驗結(jié)果可靠、靈敏度高、實驗周期短。為今后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作提供了有效的參考與借鑒。

蛋白質(zhì)組學(xué)； LC-MALDI；發(fā)標記定量

1　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)簡介

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是從整體水平上對蛋白質(zhì)的表達和功能進行分析[1],使人們對生命系統(tǒng)與活動分子機制的認識從間接的基因——核酸層次,深入到了生命活動的直接執(zhí)行者——蛋白質(zhì)層次,這在生物學(xué)研究領(lǐng)域有著劃時代的意義[2]。

隨著質(zhì)譜技術(shù)成功應(yīng)用到蛋白質(zhì)鑒定領(lǐng)域,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了快速發(fā)展,但其基本的分析思路主要有兩種:一種是基于凝膠分離蛋白,結(jié)合質(zhì)譜鑒定得到蛋白的定性和定量信息,主要包括雙向凝膠電泳技術(shù)和雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)；另一種是基于色譜分離,結(jié)合質(zhì)譜檢測完成蛋白的定性和定量分析,主要包括標記定量技術(shù)和非標定量技術(shù)[3]。最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的是雙向凝膠電泳技術(shù)[4],自從1994年蛋白質(zhì)組學(xué)一詞被提出到現(xiàn)在,其仍被生物科學(xué)研究工作者所采用,但由于其存在一定的局限性,因而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)又得到飛速的發(fā)展,標記定量技術(shù)憑借其靈敏度高、重復(fù)性好、速度快等優(yōu)點,逐漸成為了蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主流方法[5]。傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳技術(shù)平臺必不可少的組件是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-TOF),若能將MALDI-TOF-TOF與液相色譜串聯(lián)使用,組建成液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MALDI)并應(yīng)用于標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,既提高了大型儀器設(shè)備的利用率,又節(jié)約了標記定量技術(shù)平臺建設(shè)的成本。

本文通過實驗摸索,組建了LC-MALDI系統(tǒng),并建立了一套適用于LC-MALDI系統(tǒng)的標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù),主要包括蛋白提取、溶液內(nèi)酶解、肽段標記、液相分離、質(zhì)譜檢測、生物信息學(xué)分析等步驟,同時將該方法與傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳技術(shù)進行比較,分析兩者的優(yōu)缺點，并進行了客觀的評價,為今后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作者提供有效的參考思路與高效的實驗方法。

2　材料與儀器

(1) 水稻葉片:培養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院人工氣候室,取3周大的幼苗葉片立即放入液氮速凍,作為后期實驗材料。

(2) 實驗試劑:色譜級乙腈(Fisher公司,美國)；三氟乙酸(Sigma公司,德國)；α-羥基肉桂酸(Bruker公司,美國)；胰蛋白酶(Promega公司,美國)；同位素標記定量iTRAQ試劑盒(AB公司,美國)。雙向凝膠電泳實驗常用試劑購置于BIO-RAD公司,美國。

(3) 主要儀器及軟件:雙向凝膠電泳儀(BIO-RAD公司,美國)；MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀ULTRUAFELX(Bruker公司,德國)；納升液相色譜儀U3000(Dionex公司,美國)；點靶儀(Bruker公司,美國)。雙向凝膠電泳分析軟件:PDQuest7.2(BIO-RAD,美國)；液相分餾控制軟件:Chromeleon(Dionex公司,美國)；點靶儀控制軟件:Hystar 3.2(Bruker公司,美國)；搜庫軟件:MASCOT(上海康昱盛信息科技有限公司)；質(zhì)譜分析軟件:Flex Control(Bruker公司,美國)；質(zhì)譜分析程序調(diào)用軟件:Warp-LC(Bruker公司,美國)；蛋白標記定量分析軟件:ProteinScape 3(Bruker公司,美國)；生物信息學(xué)分析軟件:OmicsBean(上海金弗康生物科技有限公司)。

3　實驗方法

3.1水稻葉片總蛋白提取

采用三氯乙酸/丙酮法提取蛋白[6],最后用Bradford法測定蛋白濃度[7],均等分裝成6份,其中3份用于雙向凝膠電泳實驗,另3份用于LC-MALDI標記定量蛋白質(zhì)組分析實驗。待分析樣品均保存于-20 ℃冰箱中。

3.2雙向凝膠電泳方法

參照文獻[8]的方法進行操作。

3.3LC-MALDI實驗方法

3.3.1蛋白還原烷基化、酶解及標記

(1) 根據(jù)蛋白濃度測定結(jié)果,取100 μg水稻葉片蛋白溶液,加入二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為10 mmol/L,于56 ℃放置1 h；

(2) 加入碘代乙酰胺(IAA),終濃度55 mmol/L,常溫避光放置45 min；

(3) 加入5倍體積的丙酮(-20 ℃預(yù)冷),靜置于-20 ℃冰箱2 h；

(4) 15 000 r/min,-20 ℃離心20 min,棄上清,真空冷凍干燥沉淀物；

(5) 取40 μL iTRAQ試劑盒中的Dissolution Buffer溶解蛋白沉淀物；

(6) 按照體積比1∶40(酶與蛋白)的比例加入胰蛋白酶(濃度為1 g/L),于37 ℃放置20 h；

(7) 從冰箱中取出iTRAQ試劑盒,標記試劑各加入150 μL異丙醇,混勻離心后加入各自對應(yīng)的蛋白酶解肽段溶液中,渦旋離心混勻,室溫反應(yīng)2 h；

(8) 將標記后各溶液混合,加入100 μL水終止反應(yīng),渦旋振蕩,高速離心；

(9) 真空冷凍干燥樣品后,溶解于60 μL的三氟乙酸中,待上機測試分析。

3.3.2混合肽段的色譜分離

色譜柱:預(yù)柱為 Acclaim 120 C8 300 μm×5 mm；離子交換柱為SCX-300 μm ×150 mm；反相柱為Acclaim 120 C18 75 μm×150 mm；柱溫設(shè)置為35 ℃[9]。

流動相:A相為超純水含0.1%的三氟乙酸；B相為乙腈含0.1%的三氟乙酸。流速設(shè)置0.3 μL /min,進樣量為3 μL,梯度洗脫見表1。將12～132 min 的組分自動收集后點到樣品靶上。

表1　多肽混合樣品的梯度洗脫

3.3.3全蛋白的質(zhì)譜鑒定分析

將分離得到的多肽組分收集到樣品靶上,送入MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進行分析。質(zhì)譜采集參數(shù):正離子反射模式,一級質(zhì)譜分子量范圍為700～3 500 u,二級質(zhì)譜分子量范圍為40～1 050 u。MASCOT軟件搜庫參數(shù)設(shè)置如下:Enzyme:Trypsin；最大允許錯切位點為1；Fixed modifications為carbamidomethylation；Variable modifications為oxidized；一級質(zhì)譜容差為150×10-6；二級質(zhì)譜容差為0.5 u；概率P值≤0.05。最終以MASCOT軟件評估為陽性結(jié)果的蛋白視為蛋白鑒定成功。

3.4生物信息學(xué)分析

通過在線OmicsBean(http://www.omicsbean.com)軟件對所鑒定的蛋白進行功能分類(GO富集)、代謝途徑、互作網(wǎng)絡(luò)分析。

4　結(jié)果

4.1雙向凝膠電泳實驗

采用雙向凝膠電泳技術(shù)對水稻葉片總蛋白進行分離,實驗重復(fù)3次,結(jié)果見圖1(圖中Mr為分子量)?？傮w上看,分離效果較好,沒有橫縱條紋、蛋白點清晰;通過PDQuest7.2軟件進行分析,3次重復(fù)的實驗結(jié)果,平均每片膠有416個重復(fù)性好且斑點清晰的蛋白,可用于后期實驗定性定量分析,這與文獻[10]研究的結(jié)果類似。受數(shù)據(jù)庫等因素的影響,采用MALDI-TOF-TOF對416個水稻蛋白進行鑒定,得到水稻蛋白395個,成功率為94.9%左右,且分子量分布在10～120 ku之間,等電點主要分布在pH 4～7之間為主。對3次重復(fù)實驗分離得到的416個蛋白點的相對表達量進行偏離度分析、評價其重復(fù)性。采用公式：偏離度=[(蛋白點的相對表達量的最大值-最小值)/平均數(shù)]×100% ,發(fā)現(xiàn)416個蛋白點相對表達量的平均偏離度為18.7%。

圖1　水稻葉片雙向凝膠電泳分離圖譜

4.2LC-MALDI標記定量蛋白質(zhì)組分析

本實驗中,通過納升液相色譜分離,共收集1320個組分于樣品靶上,經(jīng)過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析及MASCOT軟件搜庫,實驗重復(fù)3次,每個樣品平均成功鑒定得到816個水稻蛋白,且其分子量分布在5～280 ku之間,等電點分布在pH 3～11之間。對3次重復(fù)實驗鑒定得到的816個蛋白的相對表達量進行偏離度分析,評價其重復(fù)性,發(fā)現(xiàn)816個蛋白相對表達量的平均偏離度為9.6%。

4.3生物信息學(xué)分析

通過在線omicsbean(http://www.omicsbean.com)軟件對所鑒定的816個蛋白進行生物信息學(xué)分析,主要分析的內(nèi)容包括蛋白功能分類(GO富集)、代謝途徑及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果見圖2—圖4。關(guān)注的是所分析的內(nèi)容和表現(xiàn)形式,圖2展示了所分析的蛋白所參與的主要生物學(xué)功能,包括:生物過程、細胞組分及分子功能,每項功能所參與的蛋白數(shù)量及所占蛋白總數(shù)的百分比均有顯示。圖3展示了所分析的蛋白參與的主要代謝途徑；圖4展示了所分析蛋白之間的相互作用關(guān)系。其結(jié)果在查詢數(shù)據(jù)庫的同時均使用統(tǒng)計學(xué)方法進行顯著分析,內(nèi)容可靠,信息量大；在表現(xiàn)形式上,圖片美觀易懂、色彩搭配適合、且具有一定的獨特性。

圖2　蛋白功能GO富集分類柱形圖

圖3　蛋白所參與的代謝途徑富集柱形圖

圖4　蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

5　討論

雙向凝膠電泳技術(shù)是最早的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分離技術(shù),相對經(jīng)典的方法，實驗結(jié)果具有圖譜,表現(xiàn)直觀易懂[11]，但由于其操作復(fù)雜、對樣品要求較高,因此表現(xiàn)出一定的局限性[12],主要有:(1)蛋白上樣量要求較多,檢測的靈敏度相對較低,尤其是低豐度蛋白基本檢測不到；(2)疏水性較強的蛋白、難溶性的跨膜蛋白、極端等電點和極端分子量的蛋白不容易檢測；(3)實驗步驟繁瑣、耗時、實驗結(jié)果重復(fù)性相對較差[13]。為此，科學(xué)家逐漸發(fā)明了標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過納升液相色譜對復(fù)雜樣品進行分離,直接經(jīng)過質(zhì)譜及數(shù)據(jù)庫比對實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的鑒定,利用同重同位素標簽標記肽段對來源于不同樣品的同一蛋白進行識別,再通過高分辨質(zhì)譜峰進行定量,從而得到復(fù)雜樣品的全蛋白定性和定量信息。本文將納升液相色譜與MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜串聯(lián)使用,組建LC-MALDI系統(tǒng),對水稻葉片蛋白組進行分析,并與雙向凝膠電泳分析的結(jié)果進行對比,發(fā)現(xiàn)LC-MALDI技術(shù)在檢測蛋白的數(shù)量、實驗的重復(fù)性、實驗所需時間方面均好于雙向凝膠電泳技術(shù)。

在生物信息學(xué)分析方面,傳統(tǒng)的方法是使用David在線工具對蛋白質(zhì)進行功能分析,通過KEGG數(shù)據(jù)庫查詢得到蛋白質(zhì)所參與的代謝途徑,再使用String軟件進行蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析,其過程涉及到不同數(shù)據(jù)庫之間的搭接,需要轉(zhuǎn)換不同數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的編號,操作復(fù)雜、耗時。本文使用的OmicsBean軟件整合了多個數(shù)據(jù)庫資源,操作簡單、分析快速、表現(xiàn)形式美觀易懂。

綜上所述,建立的基于LC-MALDI系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)所得實驗結(jié)果可靠、靈敏度高、實驗周期短,特別對于樣品量較少的復(fù)雜樣品,更具有顯著的優(yōu)勢。

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Establishment and evaluation for proteomics technology based on LC-MALDI

Chen Mo, Wang Qiuxia, Zheng Ying, Tang Ling, Zhou Shaoxia, Fu Peng, Ma Hongyu

(College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This article sets up a set of quantitative proteomics analysis technology suitable for LC-MALDI system,including protein extraction,solution hydrolases,peptides labeling,liquid phase separation,mass-spectrum detection, bioinformatics analysis, etc. At the same time, this article compares it with two-dimensional electrophoresis protocol and presents an assessment which has advantages of reliable experimental results,high sensibility and short test period. It provides an effective reference for proteomics research.

proteomics; LC-MALDI; quantitative labeling

10.16791/j.cnki.sjg.2016.09.017

2016-02-24修改日期：2016-04-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費“科研平臺實驗技術(shù)人才基金”資助(KJSY201505)

陳默(1995—)，女，江蘇徐州，本科生，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)實驗技術(shù)

E-mail： chenmo787@163.com

馬洪雨(1983—)，男，江蘇南京，博士，副教授，研究方向為大型儀器平臺建設(shè)管理.

E-mail：mahongyu@njau.edu.cn

Q51

A

1002-4956(2016)9-0061-05