徐彥芹, 楊　瑤, 朱小會, 鄭婷勻, 鐘　豪

(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 重慶　401331)

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熒光光譜標(biāo)準(zhǔn)加入法測定尿液中的水楊酸

徐彥芹, 楊瑤, 朱小會, 鄭婷勻, 鐘豪

(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 重慶401331)

以水楊酸為研究對象,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對尿液樣本中的水楊酸進(jìn)行定性和定量分析,該方法可減少基質(zhì)干擾,避免繁瑣的預(yù)處理,有效解決和實(shí)現(xiàn)了尿樣中微量水楊酸的檢測。通過實(shí)驗(yàn),使學(xué)生學(xué)會熒光光譜法的原理和測定方法,重點(diǎn)練習(xí)標(biāo)準(zhǔn)加入法和熒光光譜法的高選擇性。

尿液測定； 水楊酸； 熒光光譜法； 標(biāo)準(zhǔn)加入法

阿司匹林的主要成分是乙酰水楊酸(ASA,分子式C9H8O4),是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥[1-2]。ASA在干燥環(huán)境下穩(wěn)定,在潮濕環(huán)境下易水解為水楊酸(鄰羥基苯甲酸,SA)和乙酸鹽。因此,藥典對此有嚴(yán)格的要求,要求乙酰水楊酸藥品中游離的水楊酸含量≤0.1%[3-4]?；颊呖诜⑺酒チ趾?排泄的尿樣中主要含有與甘氨酸或葡萄糖醛酸的絡(luò)合物和微量的SA，尿樣成分復(fù)雜對SA的檢測易產(chǎn)生影響。目前常用的測定SA含量的方法有高效液相色譜法[5-7]、紫外-可見分光光度法[8-9]、滴定法[10]、庫倫滴定法[11]、近紅外光譜法[12]、比值倒數(shù)紫外吸收光譜法[13]、二階導(dǎo)數(shù)光譜法[14]等。本實(shí)驗(yàn)采用的是熒光光譜法,通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長和熒光測定波長,能夠較好地測定尿液中的SA。此方法測量準(zhǔn)確、靈敏度高。

目前,實(shí)驗(yàn)教材中大部分采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,待測樣本成分單一。生化分析中通常存在基質(zhì)干擾和目標(biāo)樣本量少的難題,本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法可減少基質(zhì)干擾,避免繁瑣的預(yù)處理,有效解決和實(shí)現(xiàn)尿樣中微量水楊酸的檢測。該方法重現(xiàn)性好,具有較好的選擇性。

1　器材與儀器

器材：RF-5310PC熒光光譜儀(日本島津公司)、分析天平(上海精密儀器儀表公司)、錐形瓶、燒杯、量筒、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶、移液管等。

試劑：水楊酸(濟(jì)寧華凱樹脂有限公司)、鹽酸(重慶川東化工公司)、冰醋酸(重慶川東化工公司)、無水乙醇(重慶川東化工公司)、尿液、所用藥品均為分析純,所用水均為二次蒸餾水。

2　實(shí)驗(yàn)

2.1母液的配制

準(zhǔn)確稱取0.076 4 g的SA,用少量的1%的HAc-C2H5OH溶解,加入5.00 mL、濃度為11.9 mol/L的鹽酸,用1%的HAc-C2H5OH定容到100 mL容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為764 mg/L的SA溶液；將上述溶液稀釋100倍(每次稀釋10倍,分2次完成)得到濃度為7.64 mg/L的SA溶液。

2.2尿液合成樣本的配制

準(zhǔn)確稱取0.015 0 g的SA,用少量的1%的HAc-C2H5OH溶解,依次加入5.00 mL、濃度為11.9 mol/L的鹽酸、10.00 mL尿液,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用1%的HAc-C2H5OH定容,稀釋100倍后得到質(zhì)量濃度為1.50 mg/L尿液合成樣本。

2.3測定SA的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長

打開RF-5301PC熒光光譜儀的燈電源和主機(jī)電源，預(yù)熱30 min后,啟動工作站,選擇Spectrum界面,發(fā)射波長(EM)為450 nm,掃描范圍260～380 nm,狹縫寬度為5 nm，測定SA的熒光激發(fā)光譜和最大激發(fā)波長，再以最大激發(fā)波長測定7.64 mg/L的SA溶液的發(fā)射光譜和發(fā)射波長。

2.4熒光光譜的測定

移取3.00 mL、質(zhì)量濃度為1.50 mg/L的SA尿液合成樣本,用1%的HAc-C2H5OH定容至50 mL容量瓶,配制成質(zhì)量濃度為0.09 mg/L的SA尿液合成樣本溶液。設(shè)置EX(激發(fā)波長)與EM分別為310 nm、440 nm，測定該溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。

2.5標(biāo)準(zhǔn)加入法測定尿樣中SA含量

取5份5.00 mL的尿液合成樣本,依次加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的SA標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制得到濃度依次為:Cx1、(Cx1+1)、(Cx1+2) 、(Cx1+3)、(Cx1+4) mg/L的SA溶液(其中Cx1為待測的SA濃度)；設(shè)置激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為310 nm、440 nm；依次測定SA各濃度溶液的熒光強(qiáng)度。

2.6回收率的測定

在5.00 mL尿液樣品中分別加入5.00、7.00、9.00、11.00、13.00 mL，質(zhì)量濃度為7.64 μg/mL的SA溶液,用1%的HAc-C2H5OH定容至25 mL容量瓶,分別測定其熒光強(qiáng)度,并計算其回收率。

測定完畢后,關(guān)閉RF-5301PC熒光光譜儀(先關(guān)燈電源,再關(guān)主機(jī)電源)。

3　結(jié)果與討論

3.1SA的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

測得的7.64 mg/L的SA的熒光激發(fā)光譜見圖1(圖中λ為波長，I為相對熒光強(qiáng)度),測得最大激發(fā)波長為310 nm；設(shè)置EX為310 nm,掃描范圍380～510 nm,得到SA的熒光發(fā)射光譜見圖2,測得最大發(fā)射波長為440 nm。

圖1　7.64 mg/L的SA的熒光激發(fā)光譜

圖2　SA的熒光發(fā)射光譜

3.2熒光光譜分析

測得質(zhì)量濃度為0.18 mg/L的SA尿液合成樣本的熒光光譜見圖3,測得SA的熒光強(qiáng)度大于尿液的熒光強(qiáng)度,說明在尿液合成樣本中,熒光光譜法測定SA可以有效地避免其他成分的干擾,檢測效果較好。

圖3　0.18 mg/L的SA尿液合成樣本的熒光光譜

3.3標(biāo)準(zhǔn)加入法測定尿液合成樣本中的SA含量

以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),SA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線結(jié)果見圖4。用SA溶液的標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線求得Cx1為0.015 mg/L,線性較好,說明標(biāo)準(zhǔn)加入法測定SA可以較好地排除尿液樣本中其他成分的干擾,實(shí)現(xiàn)高選擇性的檢測SA。

圖4　SA的標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線

3.4回收率的測定

由測定的熒光強(qiáng)度計算得到的回收率見表1，其回收率在99.1%～102.1%之間,由此可得本實(shí)驗(yàn)有較高的準(zhǔn)確性。

表1　加入SA的回收率測定結(jié)果

4　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法建立了一種測定尿液中SA含量的方法,該方法準(zhǔn)確度高,簡便、靈敏,樣品回收率符合要求,是一種有效的藥物分析方法。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量計算尿液中SA的含量,據(jù)此方法求得尿樣中SA的含量為0.015 mg/L。進(jìn)一步驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)加入法測定SA可以更好地排除尿液樣本中其他成分的干擾,提高熒光光譜法檢測SA的選擇性,使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

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Determination of salicylic acid in urine by using fluorescence spectrum standard addition method

Xu Yanqin, Yang Yao, Zhu Xiaohui, Zheng Tingyun, Zhong Hao

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University, Chongqing 401331, China)

Taking salicylic acid as the object of the research, this experiment adopts the standard addition method to do qualitative and quantitative analysis of salicylic acid in urine. It can reduce matrix interference,avoid tedious pretreatment and implement an effective solution to detect trace amounts of salicylic acid in urine. Through the study of this experiment,students can grasp the determination method and the theory of fluorescence spectrometry. The experiment mainly lets students grasp the practical standard addition method and high selectivity of fluorescence spectroscopy.

determing urine; salicylic acid； fluorescence spectrum method； standard addition method

10.16791/j.cnki.sjg.2016.09.014

2016-03-10

重慶市高等教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目(143055，151003)；第六屆“重慶大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計劃”項(xiàng)目(CQU-SRTP-2015480，CQU-SRTP-2015504)

徐彥芹(1984—)， 女， 山東單縣， 碩士， 實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作.

E-mail：xuyanqin666@163.com

O657.39；R446.12

B

1002-4956(2016)9-0050-03