辛 勵,陳延玲,劉樹堂,劉錦濤,袁銘章,南鎮(zhèn)武

(青島農(nóng)業(yè)大學,山東 青島 266109)

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長期定位秸稈還田對土壤真菌群落的影響

辛 勵,陳延玲,劉樹堂,劉錦濤,袁銘章,南鎮(zhèn)武

(青島農(nóng)業(yè)大學,山東 青島 266109)

為了研究不同秸稈還田條件對土壤真菌群落的影響,利用連續(xù)進行6年的萊陽潮土區(qū)長期定位秸稈還田試驗與ITS rRNA擴增子測序技術,研究了小麥、玉米秸稈還田條件下,各處理土壤真菌群落的微生物多樣性變化。結果表明,施用秸稈和有機肥能夠提高土壤真菌群落多樣性。秸稈還田后土壤真菌優(yōu)勢種群為子囊菌、接合菌和擔子菌。主成分分析表明,各處理間微生物含量存在差異。兩季秸稈還田配施氮肥處理能顯著增加土壤全氮、有效磷、有效鉀、有機碳含量。兩季秸稈還田配施氮肥處理的土壤全氮、有效磷、有效鉀、有機碳含量與蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活性顯著高于兩季秸稈還田處理,與此同時,兩季秸稈還田配施氮肥提高了當季玉米產(chǎn)量。這說明,秸稈還田施用氮肥顯著增加土壤養(yǎng)分含量,增強土壤酶活性,有利于土壤真菌群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高,改善土壤生態(tài)環(huán)境,從而促進作物增產(chǎn)。

長期定位;ITS rRNA;真菌群落;秸稈還田

秸稈是普遍存在的有機物料。大量研究表明,連續(xù)的秸稈還田能夠提高土壤微生物群落多樣性,為土壤提供大量養(yǎng)分,可建立一個良好的土壤生態(tài)體系[1]。土壤真菌廣泛分布在各種土壤環(huán)境中,與土壤微生物活性密切相關,是評價土壤質量的重要生物活性指標[2-3]。在大多數(shù)酸性土壤中(pH值低于5),真菌數(shù)量相對較多,因此在這些土壤中,真菌所起作用較大[4]。土壤真菌是農(nóng)田生態(tài)循環(huán)的重要調解者之一。由于真菌對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)的重要作用,土壤真菌一直受到廣大學者的關注。

Kjouer等[5]研究表明長期單施化肥會明顯降低土壤真菌的多樣性;而李秀英等[6]研究表明長期單施化肥對土壤微生物影響并不明顯。單施氮肥會使真菌的豐度降低。土壤微生物的種群數(shù)量直接關系到土壤中有機質的分解和礦質元素的轉化,影響作物對營養(yǎng)元素的吸收和利用[7]。目前,土壤微生物群落多樣性對長期秸稈還田配施化肥的響應機制還不明確。

迄今為止,對于華北地區(qū)潮土真菌的多樣性研究,多數(shù)以其分布規(guī)律、酶活性等為基礎來研究土壤真菌群落結構以及代謝特征;而在分子水平上,特別是利用ITS rRNA基因測序技術對土壤真菌的微生物多樣性進行的研究報道很少見[8-9]。本研究依托華北潮土區(qū)長達6年的小麥-玉米輪作秸稈還田長期定位試驗,在不同秸稈還田施肥處理下,通過高通量測序以及DNA擴增因子測序反映出秸稈還田各處理真菌的物種的豐度、變化程度以及均勻度,揭示了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的真菌群落組成與結構的基本差異,較為客觀地反映了真菌群落的真實情況,從而為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的健康管理提供了量化依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

試驗設在青島農(nóng)業(yè)大學萊陽實驗站。土壤為非石灰性潮土。施肥前耕層土壤全氮量0.60 g/kg,全磷量0.64 g/kg,土壤有效磷16.34 mg/kg,土壤速效鉀72.00 mg/kg,陽離子代換量為13.80 cmol/kg,pH 值6.8,土壤有機質含量為5.01 g/kg。

試驗始于2009年秋。試驗設置5個處理:分別為對照(CK)、單施有機肥60 000 kg/hm2(M)、兩季秸稈還田(WC)、一季秸稈還田+施氮肥276 kg/hm2(WN)、兩季秸稈還田+施氮肥276 kg/hm2(WCN)。每個處理3個重復,同時設置空白對照(CK),隨機區(qū)組排列,其間均設保護行。

試驗地實行冬小麥-夏玉米輪作制,每年兩作。冬小麥品種為煙優(yōu)361;夏玉米品種為魯玉16號。無機肥用尿素,高量氮肥每年施用276 kg/hm2。有機肥用豬圈糞,含全氮量為2～3 g/kg,含全磷量為0.5～2.0 g/kg,有機質含量為20～50 g/kg,干燥的玉米、小麥秸稈其全氮含量平均為1.93%,施用高低量均以與無機氮肥等含氮量計算。

1.2 樣品采集

土壤樣品在2014 年玉米收獲期采集,各小區(qū)按“S”形多點采樣法取表層(0～20 cm)土壤混合,混勻后作為該施肥處理的1個土壤樣品,取200 g 新鮮土壤冷凍后保存,供分子生物學研究。

1.3 土壤養(yǎng)分的測定

有機質測定采用重鉻酸鉀容量法;堿解氮測定采用堿解擴散法;速效磷測定采用0.5 mol/L NaHCO3法;速效鉀測定采用醋酸銨浸提-火焰光度計法;用pHS-3c儀器測定pH值[10]。

1.4 高通量測序及數(shù)據(jù)處理

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取,之后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣品于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。稀釋后的基因組DNA為模板;根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode的特異引物;使用New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶進行PCR,確保擴增效率和準確性。 引物對應區(qū)域:16S V4區(qū)引物為515F-806R;18S V4區(qū)引物為528F-706R;18S V9區(qū)引物為1380F-1510R;ITS1區(qū)引物為ITS1-5F-ITS2;ITS2區(qū)引物為:ITS2-3F-ITS2-4R。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測;根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,使用Thermo Scientific公司的GeneJET 膠回收試劑盒回收產(chǎn)物[11]。

1.4.1 文庫構建和上機測序 使用New England Biolabs公司的NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,合格后使用MiSeq進行上機測序[12]。

1.4.2 信息分析流程 為了使信息分析的結果更加準確、可靠,首先對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾,得到有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析,并將OTU和物種注釋結合,從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs豐度、多樣性指數(shù)等進行分析,同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。 最后在以上分析的基礎上,可以進行一系列的基于OTUs、物種組成的聚類分析,PCA統(tǒng)計比較分析,挖掘樣品之間的物種組成差異,并結合環(huán)境因素進行關聯(lián)分析[13-17]。

2 結果與分析

2.1 不同施肥對土壤養(yǎng)分的影響

與CK處理相比,長期秸稈還田(WN、WC、WCN)和有機肥(M)處理顯著增加土壤全氮、有效磷、有機碳含量,尤其是長期秸稈還田與氮肥或有機肥單獨應用。長期秸稈還田和施肥處理不影響土壤的pH值(表1)。各處理玉米產(chǎn)量差異顯著,不同處理間M>WCN>WN>WC>CK。從表2可以看出,WCN處理與WC、WN處理相比玉米產(chǎn)量顯著增加31.7%,26.9%。3種不同秸稈還田和有機施肥處理的土壤蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活力的影響均顯著提高。其中,WC處理土壤酶活性最低,WCN處理酶活性最高,WN和M處理次之。

表1 不同處理土壤養(yǎng)分含量與pH值

注:CK.對照;WC.玉米-小麥兩季秸稈還田;WN.小麥秸稈還田配施276 kg/hm2氮肥;M.有機肥,6 000 kg/hm2豬糞;WCN.小麥玉米秸稈還田配施276 kg/hm2。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

Note:CK.Control;WC.Maize-wheat season straw;WN.Wheat straw returned to the field with application of 276 kg/ha N.M.Organic fertilizer,6 000 kg/ha,pig manure;WCN.Wheat and maize straw returned to the field with 276 kg/ha N.The different small letters represent significant difference (P<0.05).The same as Tab.2.

表2 不同處理土壤蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活性與玉米產(chǎn)量相關性

2.2 稀釋曲線

對Illumina MiSeq/HiSeq 測序平臺得到的下機數(shù)據(jù)進行預處理,獲取Tags值,默認提供以97%和95%的一致性將序列聚類成為OTUs,繪制稀釋曲線。如圖1 所示,測序數(shù)據(jù)量足夠大,各處理曲線趨向平滑,表明樣品物種的豐富程度較高,本試驗可信度較高,能夠反映各處理樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。各處理中,WCN處理OTU數(shù)最高。

2.3 物種分類鑒定結果

通過序列優(yōu)化過程中獲得了1 200多個有效讀取,并計算了真菌群落豐富度指數(shù),如表3所示。WC、WN、M和WCN樣品OTUs值分別高出CK處理163,77,185和72。Shannon和Chao1表明,與CK處理相比,秸稈還田和有機肥處理提高土壤真菌群落多樣性。

圖1 物種豐富度稀釋曲線

處理TreatmentsObservedOTUsShannonChao1真菌Fungus細菌Bacteria真菌Fungus細菌Bacteria真菌Fungus細菌BacteriaCK13525133.1249.11163.702825.6WC29829645.6899.73541.083217.6WN21231373.5909.80398.483413.8M32029485.3669.85358.613241.2WCN20732642.7699.98269.573766.5

注：Shannon.香濃-威廉姆指數(shù)，表示群落多樣性與復雜度，數(shù)值越大群落多樣性越高。

Note:Shannon.Aromatic-William index,community diversity and complexity,the greater the value the higher the community diversity.

2.4 土壤真菌物種聚類OTU分析及物種注釋

用 Uparse 軟件對所有樣品的全部Tags 序列聚類,默認提供以97%的一致性將序列聚類成為OTUs結果,按所有樣品間序列最小值對OTUs聚類結果進行標準化處理后,對不同樣品的Tags數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計,平均有效序列得到了290個OTUs,注釋到7個門。這些土壤樣本中有7個門水平存在差異,其中子囊菌門在所用樣本中豐度最高,接合菌亞門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidimoycota)以及子囊菌門(Ascomycota)相對豐富也較高,同時也發(fā)現(xiàn)了一些含量稀少的門(圖2)。

對CK、WN、WCN、M、WC處理的樣品的OTUs進行比較分析,其他各處理相較于CK條帶數(shù)量都較多,表明秸稈還田土壤環(huán)境中,真菌的多樣性比較高。各個處理的條帶數(shù)目和位置均不同。這表明在經(jīng)過不同秸稈還田方式處理后土壤真菌群落的多樣性有一定的變化。發(fā)現(xiàn)237個重疊的微生物種屬,推斷這些微生物物種可能是玉米或者小麥攜帶的真菌。

橫坐標是處理名;縱坐標表示相對豐度;其他物種表示最大相對豐度(某個門在所有樣品中相對豐度的最大值)最高的10個門之外的所有門的相對豐度的和。

Abscissa is the treatments names;Ordinate represents the relative abundance;Others said maximum relative abundance (a door in all samples in the maximal relative abundance values outside).The highest relative abundance of all the doors outside the 10 gates.

圖2 土壤真菌物種聚類OTU分析

Fig.2 Analysis of soil fungal species cluster OTU

橫向為處理信息,縱向為物種注釋信息,圖中左側的聚類樹為物種聚類樹;上方的聚類樹為樣品聚類樹;中間熱圖對應的值為每1行物種相對豐度經(jīng)過標準化處理后得到的Z值,即一個處理在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有處理在該分類的平均相對豐度的差除以所有處理在該分類上的標準差所得到的值。

Transverse treatment information,longitudinal species annotation information,clustering tree on the left side of the figure as a species tree clustering;Above the clustering tree to treatment cluster tree;Intermediate thermography corresponding values for each species relative abundance after standard treatment after the Z value,namely a treatment in a classification of Z value for treatments in the classification of the relative abundance of and all treatments in divided by the difference of the classification of the mean relative abundance of all the treatments in the classification of standard difference the obtained values.

圖3 真菌物種豐富度聚類圖

Fig.3 The species richness of fungi

2.5 不同施肥處理物種豐度聚類

根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前35的屬及其在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖,并從分類信息和樣品間差異2個層面進行聚類,結果展示見圖3。

不同的施肥處理創(chuàng)造了不同的土壤環(huán)境,進而影響土壤真菌的數(shù)量以及不同處理間種類分布特征。秸稈還田后的土樣相對于對照組,土壤真菌的多樣性顯著增加,WN、WCN、M、WC處理酒香酵母菌(Brettanomyces)、籃狀菌(Talaromyces)、玫紅假裸囊菌(Pseudogymnoascus)以及圓盤菌科(Un-s-Orbiliaceae_sp)4種菌類豐度Z值較低,說明這4種菌類為CK處理特有的菌類。WN處理的粉褶蕈屬(Entoloma)、翹孢霉屬(Emericella)、隱球菌(Cryptococcus)以及外瓶霉(Exophiala)菌類豐度熱度值較高,說明這4種菌類為WN處理的特有菌類。WCN處理傘菌綱(Un-s-Agaricomycetes_sp)、糙孢孔菌(Un-s-Trechisporales_sp)、柔膜菌(Un-s-Helotiales_sp)豐度熱度值值較高,為WCN處理特有菌類。WC處理為曲霉(Aspergillus)、卷旋孢霉(Helicoma)、錐蓋傘霉(Conocybe)、茶樹菇(Agrocybe)熱度值較高。

2.6 樣品復雜度分析

2.6.1 主成分分析 如圖4所示,第一主成分貢獻率達42.43%,第二主成分貢獻率達28.62%,因子1和因子2代表總變量的71.05%。 在這2個主成分為坐標軸構建的二維坐標系中,各個處理在主成分分析圖上分布差異顯著,M處理明顯與其他處理分布位置不同,5組樣本間的微生物組成存在差異,不同秸稈還田處理與對CK比都發(fā)生了明顯的位置變化,但又明顯被分為3組,其中WC、WN、WCN距離較近,WN與其他處理相比最接近WCN處理說明秸稈還田處理的土壤真菌的多樣性優(yōu)于CK與M處理,其中WCN處理對土壤真菌群落組成影響最大,各處理對土壤真菌群落結構的影響存在差異。在圖4

坐標系中,WCN處理與WC處理相距最遠,這表明相同秸稈還田條件下,WCN與WC處理相比土壤真菌群落結構發(fā)生了較大的變化,氮肥的施用對土壤真菌的作用效果不同,造成了相應處理間土壤真菌群落結構的差異。

橫坐標表示第一主成分,百分比則表示第一主成分對處理差異的貢獻值;縱坐標表示第二主成分,百分比表示第二主成分對處理差異的貢獻值;圖中的每個點表示一組具有代表性的樣品。

The abscissa said the first principal component and percentage said value contribution of the first principal component of different treatments;the ordinate represents the second principal component,expressed as a percentage value of the second principal component contribution of different treatments,each point in the graph said a important sample.

圖4 基于門水平的PCA分析結果展示

Fig.4 PCA analysis based on the phylum level of the fungus

2.6.2 樣品聚類分析 在圖5中,由在門水平上物種豐度統(tǒng)計結果所做的UPGMA聚類分析可以看出,不同處理之間真菌群落結構有明顯的差異,各處理均有其優(yōu)勢門。各處理子囊菌門(Ascomycota)、接合菌亞門(Zygcmycota)、擔子菌門(Basidiomycota)含量較高,為三大常見真菌類。其中WN處理子囊菌門(Ascomycota)相對豐度較大;CK處理接合菌亞門(Zygcmycota)距離最大,說明其含量較為豐富;WCN處理擔子菌(Basidiomycota)擔子菌距離較大。WC處理真菌豐度分布與M處理相近,這表明秸稈降解以及追加的肥料(氮肥)對微生物的繁殖和生長具有一定的促進和誘導作用,特別是可利用秸稈的土壤微生物的種群增多。

圖5 真菌 UPGMA聚類分析

3 討論與結論

秸稈結構非常復雜,它是由多種不同成分組合而成。主要包括纖維素、半纖維素、木質素以及水溶性多糖等物質[17]。這些物質的充分降解往往需要多種酶類的共同作用,甚至多種微生物類群的聯(lián)合作用。作物秸稈本身含有豐富的氮磷鉀等主要營養(yǎng)元素,秸稈還田后,伴隨秸稈的分解,養(yǎng)分得到釋放,增加了土壤養(yǎng)分含量。本試驗也表明秸稈還田,尤其是秸稈還田配施氮肥能增加土壤養(yǎng)分含量。因此,秸稈還田必須結合有機、無機肥料的施用方可發(fā)揮最大的作用。

Kimura等[18]的研究結果顯示,秸稈降解過程中確實存在著復雜的微生物群系。有機和無機肥料可提供作物生長所必需的元素,根系的生長和生理活性增加,根系分泌物能促進土壤真菌的繁衍,使其生命活動旺盛,引起與根際效應直接相關聯(lián)的子囊菌門、接合菌門相對豐度增加。真菌構成了土壤的大部分微生物生物量[19]。物種豐度圖譜分析表明秸稈還田后土壤具有較高豐度的子囊菌門和接合菌類。比較不同處理之間的差異,結果表明不同施肥處理間真菌群落結構差異顯著,其中秸稈和氮肥是影響真菌群落組成的主要因素。另外,從物種豐度聚類分析的結果中可以發(fā)現(xiàn),在不同的施肥條件下,不同耕作處理和秸稈管理(化肥與有機肥,秸稈還田與不還田)對土壤真菌影響都有很大差異。

長期施肥(氮肥配施和秸稈還田)提高了土壤肥力和質量,改善了真菌生長的生境條件,真菌種群多樣性明顯高于不施肥(CK)處理。不同處理之間微生物的群落結構有明顯的差異。這表明秸稈降解以及追加的肥料(氮肥)對微生物的繁殖和生長具有一定的促進和誘導作用,特別是可利用秸稈的土壤微生物的種群增多。雖然土壤真菌的數(shù)量和種類受土壤層次、氣候變化及土壤類型等諸多因素影響,但秸稈與化肥對土壤真菌群落有較大影響,長期秸稈還田條件下,配施氮肥有利于土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高,有利于土壤生態(tài)環(huán)境的改善[15]。

主成分的分析結果表明,施用化學肥料、秸稈還田可以顯著的提高土壤的真菌數(shù)量,施肥能不同程度地促進或抑制土壤微生物數(shù)量,影響根際土壤生理活性,尤其是有機肥能夠促進根際真菌的繁殖[20-22]。隨著長期施氮肥,土壤真菌群落為應對外界環(huán)境的變化自發(fā)的調整結構類型,同時顯示出一定的穩(wěn)定性[23]。由此可見,不同秸稈還田與施肥措施不僅改變了原土壤真菌群落的微環(huán)境,也影響了土壤真菌群落結構組成。其中秸稈還田真菌數(shù)量的增幅效果最大。5個處理土壤中真菌的群落結構都具有較大的差異,其中兩季秸稈還田配施氮肥這一因子對土壤真菌群落結構具有較大影響,同時結合多樣性分析,可以看出,小麥秸稈和有機肥這2個因子對土壤真菌群落結構也有一定的影響,影響程度和玉米秸稈相比較小。

秸稈還田配施氮肥、單施有機肥均能極大提高土壤養(yǎng)分含量。秸稈還田的同時配施適量氮肥提高了植物根際和土壤中微生物活性,使植物秸稈更易分解,能快速轉化成土壤中養(yǎng)分,從而在短時期內使作物增產(chǎn)。

秸稈還田與施肥能不同程度地促進或抑制土壤真菌生長,以秸稈還田為主的施肥技術能夠增加真菌活力，改善土壤中真菌群落結構,提高土壤質量。

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Fungal Community Development of Long-term Straw Returning Soil

XIN Li,CHEN Yanling,LIU Shutang,LIU Jintao,YUAN Mingzhang,NAN Zhenwu

(Qingdao Agriculture University,Qingdao 266109,China)

A next-generation,Illumina-based sequencing approach was used to characterize the bacterial community development of the long-term straw returning soil.Five treatments (soil without fertilizer,wheat and corn straw returning,wheat straw returning,manure,and wheat and corn straw returning) were tested in this study.In this study,the microbial diversity of soil fungi was studied by ITS rRNA PCR technology.The results showed that the community was composed of 3 dominant groups (Ascomycota,Zygomycota,Basidiomycota).Principal component analyses revealed that the microbiota were significantly different among treatments.The WCN treatment could significantly increase soil total nitrogen,available phosphorus,available potassium,and organic carbon content.The WCN treatment showed relatively higher soil total N,available P,available K,and organic carbon and invertase,urease,and cellulase activities than WC treatment,and this treatment also had the higher maize yield.Our experimental results suggested that application of N fertilizer at straw returning soil had significantly higher soil fertility,enzyme activities than straw returning,alone,which resulted in a different bacterial community composition.

Long-term experiment;ITS rRNA;Soil fungal community;Straw returning

2016-06-12

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203030)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設經(jīng)費項目(SDAIT-01-022-06)；魯東丘陵區(qū)小麥玉米水肥自然資源高效利用綜合技術集成與示范研究項目(2013BAD07B06-03)

辛 勵(1991-),男,山東安丘人,碩士,主要從事植物營養(yǎng)方面的研究。

劉樹堂(1962-),男,山東安丘人,教授,博士,碩士生導師,主要從事植物營養(yǎng)與施肥技術的研究。

S158

A

1000-7091(2016)05-0186-07

10.7668/hbnxb.2016.05.028