劉紫君,咸拴獅,王耀輝,范建春,王景雪,杜春芳

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所,山西 運(yùn)城 044000)

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甘藍(lán)型油菜高/低含油量近等基因系構(gòu)建及鑒定

劉紫君1,咸拴獅2,王耀輝1,范建春2,王景雪1,杜春芳2

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所,山西 運(yùn)城 044000)

為了探討油菜種子中脂肪酸代謝調(diào)控的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的高油基因,為高油育種研究提供基礎(chǔ)材料,構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜高/低含油量近等基因系。以高油品系NJ9為基礎(chǔ)試材,連續(xù)自交2代后,選擇農(nóng)藝性狀基本一致、含油量不同的姐妹系30份,進(jìn)行連續(xù)自交和含油量的選擇,最終獲得9份擬近等基因系材料。以來源于蕓薹屬DB公共數(shù)據(jù)庫的156對(duì)SSR引物對(duì)9份擬近等基因系株系材料進(jìn)行擴(kuò)增,篩選出32對(duì)引物用于近等性分析。基于32對(duì)SSR引物PCR擴(kuò)增結(jié)果,經(jīng)過遺傳相似性系數(shù)估算以及聚類分析,結(jié)果顯示,9份擬近等基因系試材遺傳相似性系數(shù)均為0.85～0.94,其中,YC13-554和YC13-559的遺傳相似性系數(shù)最大,為0.94,確定其為近等基因系。成熟期農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果,進(jìn)一步確定YC13-554和YC13-559為高/低含油量近等基因系。結(jié)果表明,連續(xù)自交和定向選擇的方法可用于構(gòu)建近等基因系,豐富了近等基因系的來源。

油菜;近等基因系;近等性分析;SSR分子標(biāo)記;遺傳相似系數(shù)

油菜作為一種重要的油料作物,在世界范圍內(nèi)廣泛種植,是僅次于大豆的第二大植物油脂來源。油菜籽中豐富的油酸、亞油酸對(duì)人體具有重要的保健作用[1-3]。因此,油菜的含油量研究及其高油品種選育逐漸成為研究熱點(diǎn)。

國內(nèi)從20世紀(jì)80年代以來,加強(qiáng)了含油量的育種工作,目前我國油菜育種者已經(jīng)選育了一批含油量高達(dá)50%～60%的優(yōu)良品系和高產(chǎn)雜交種[4],尤其是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所王漢中研究員選育的油菜品系YN171,含油量高達(dá)64.8%,刷新了油菜含油量最高世界紀(jì)錄。隨著高油育種的不斷深入,含油量調(diào)控機(jī)制不明、高油資源匱乏等問題不斷凸顯。利用近等基因系,從基因水平研究含油量調(diào)控機(jī)制、聚合優(yōu)良基因?qū)⑹沁M(jìn)一步提高油菜含油量的有效方法。由于近等基因系的遺傳背景相似,只有少數(shù)基因間有差異,因此,近等基因系在植物育種、分子標(biāo)記、基因克隆和基因調(diào)控機(jī)理研究等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景[5-7]。

本試驗(yàn)利用連續(xù)自交的方法構(gòu)建了一組甘藍(lán)型油菜含油量不同的擬近等基因系,并利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)所構(gòu)建的擬近等基因系進(jìn)行鑒定,結(jié)合農(nóng)藝性狀分析,確定了高含油量/低含油量2個(gè)近等基因系,旨在為進(jìn)一步研究油菜種子中脂肪酸積累的機(jī)制提供理論依據(jù),并為油菜高油品種選育提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)用于構(gòu)建近等基因系的基礎(chǔ)試材為NJ9,由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所油菜育種課題組從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)的高代育種材料。

用于近等性分析的9份擬近等基因系材料來自于NJ9高代自交姐妹系。分別是:YC13-554、YC13-559、YC13-5142、YC13-5145、YC13-6109、YC13-6113、Y13-6146、YC13-6147、YC13-9133。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 近等基因系構(gòu)建 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所油菜課題組2009年以外引的油菜高代自交系NJ9為原始試材,首先進(jìn)行2代的自交馴化。隨后選擇適應(yīng)性好、整齊一致的自交材料,然后以此為基礎(chǔ)群體進(jìn)行品質(zhì)分析,從中選出30個(gè)農(nóng)藝性狀基本一致的單株;在翌年對(duì)這30個(gè)單株繼續(xù)進(jìn)行自交和選擇,其原則是:農(nóng)藝性狀相同,含油量向2個(gè)方向選擇(高含油量和低含油量)。

1.2.2 總DNA提取 供試材料播種于花盆中,待幼苗長到3～5片真葉時(shí),取幼嫩葉片,用CTAB法提取基因組總DNA,備用[8]。

1.2.3 SSR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化 SSR引物的選取參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行:從蕓薹屬(Brassica) DB公共數(shù)據(jù)庫(http://brassica.bbsrc.ae.uk/cgi-binace/searches/browser/BrassicaDB)中選取DNA序列并設(shè)計(jì)引物,共設(shè)計(jì)了156對(duì)引物。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

種植擬近等基因系試材,在幼苗期提取基因組總DNA。以總DNA為模板,用156對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增,重復(fù)2次,篩選擴(kuò)增帶型清晰易辨、重復(fù)性好的SSR引物備用。同時(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化。

以篩選到的SSR引物和優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件重新對(duì)擬近等基因系總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。凝膠采用銀染檢測,數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用篩選出來的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳圖譜中,擴(kuò)增出來的每一條條帶代表引物的1個(gè)結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)被視為有效的分子標(biāo)記。同1對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的被視為具有同源性[10];所有引物檢測到的每1個(gè)條帶視為1個(gè)等位變異。將凝膠電泳圖轉(zhuǎn)換為電子圖譜。以(0,1)矩陣標(biāo)記結(jié)果,電泳圖譜中的清晰條帶記為“1”,無帶記為“0”。用NTSYSpc 2.10軟件計(jì)算遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離指數(shù),使用非加權(quán)組平均法UPGMA進(jìn)行聚類分析[11]。

1.2.5 農(nóng)藝性狀鑒定 2015年在成熟期對(duì)選定的近等基因系隨機(jī)選取10株進(jìn)行農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀的測定。測定項(xiàng)目包括:株高、有效分枝數(shù)、第1次有效分枝部位高度、主花序有效長度、主花序有效角果數(shù)、全株有效角果數(shù)、每果粒數(shù)、千粒質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬近等基因系構(gòu)建

NJ9在運(yùn)城地區(qū)長勢較弱,適應(yīng)性較差,經(jīng)過2年對(duì)自交后代進(jìn)行整齊度和適應(yīng)性的馴化和選擇,從中選出了長勢強(qiáng)、整齊度高、抗寒耐病性好的YC10-428品系。2011年在YC10-428自交后代中選擇了農(nóng)藝性狀整齊一致的30個(gè)單株進(jìn)行套袋自交。收獲單株后,連續(xù)2年通過對(duì)自交后代的農(nóng)藝性狀和含油量進(jìn)行分析,共選擇了9份含油量不同的擬近等基因系:YC13-554、YC13-559、YC13-5142、YC13-5145、YC13-6109、YC13-6113、Y13-6146、YC13-6147、YC13-9133。2014年對(duì)這些株系進(jìn)行進(jìn)一步的品質(zhì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些擬近等基因系試材農(nóng)藝性狀高度相似,但在含油量上差異較大(表1)。

表1 擬近等基因系種子油脂成分分析

注:表中數(shù)據(jù)全部來源于FOSS近紅外分析儀TR-3750測定的結(jié)果;負(fù)值表示含量很低(因?yàn)镕OSS近紅外分析儀是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析,如果含量低于標(biāo)準(zhǔn)曲線則測定值即為負(fù)值)。

Note:Data in the table are from the FOSS near infrared analyzer TR-3750 determination results;a negative value indicates that the content is very low(Because the FOSS near infrared analyzer in oil measurement accuracy is not very high,if the content is lower than the standard curve of measured value is negative).

2.2 擬近等基因系的近等性分析

2.2.1 SSR引物篩選 為了鑒定選擇的擬近等基因系是否為近等基因系,本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)這些試材進(jìn)行了鑒定。首先進(jìn)行了引物篩選,以9份甘藍(lán)型油菜擬近等基因系試材總DNA為模板,對(duì)156對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選,共選到32對(duì)條帶清晰、重復(fù)性好的引物(表2)。

表2 SSR引物名稱及等位基因數(shù)

2.2.2 擬近等基因系分子檢測 按照1.2.3的方法,對(duì)SSR擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,SSR分子標(biāo)記的PCR最佳反應(yīng)體系為25 μL,包含總DNA模板(50 ng)1 μL,10×ESTaqBuffer 2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,2.5 U/μL ESTaqDNA聚合酶0.25 μL,10 mmol/L SSR上游引物0.5 μL,10 mmol/L SSR下游引物0.5 μL,超純水 18.75 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。用篩選出來的重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰的32對(duì)SSR引物對(duì)9份油菜試材進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1為以9份甘藍(lán)型油菜擬近等基因系試材為模板,以SSR17、SSR18、SSR19為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。

1～9.擬近等基因系材料YC13-9133、YC13-5142、YC13-6147、YC13-6146、YC13-5145、YC13-6113、YC13-6109、YC13-554和YC13-559;M.DNA Marker。

1-9.Near-isogenic line meteral YC13-9133,YC13-5142,YC13-6147,YC13-6146,YC13-5145,YC13-6113,YC13-6109,YC13-554 and YC13-559;M.500 bp DNA Marker.

圖1 擬近等基因系的SSR引物17,18,19的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 The result of amplification of SSR primer 17,18,19 with near-isogenic-line

由圖1可知,所有引物共擴(kuò)增出614條條帶,其中,多態(tài)性條帶93條;平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.9條多態(tài)性條帶。

2.2.3 擬近等基因系的遺傳相似性及聚類分析 按照1.2.4的方法,對(duì)獲得的SSR電泳圖進(jìn)行分析,繪制聚類圖譜,結(jié)果如圖2所示。

圖2 擬近等基因的遺傳相似性及SSR聚類分析結(jié)果

從圖2可以看出,9份油菜材料的遺傳相似性系數(shù)均為0.85～0.94。其中,在相似性系數(shù)0.85水平上將上述9份油菜材料分為2組,Ⅰ組包括YC13-9133和YC13-6147;Ⅱ組包括YC13-5142、YC13-6146、YC13-6113、YC13-6109、YC13-554、YC13-559、YC13-5145。在相似性系數(shù)為0.866水平上,將第Ⅱ組分為2大亞組,其中，YC13-5145單獨(dú)聚為第1亞組,YC13-5142、YC13-6146、YC13-6113、YC13-6109、YC13-554、YC13-559為第2亞組;在0.882水平上將第2亞組再次分為2組,其中YC13-554、YC13-599聚為1組,YC13-5142、YC13-6146、YC13-6113、YC13-6109聚為另1組。表明所有9份擬近等基因系材料的親緣關(guān)系很近,其中,YC13-554和YC13-559的遺傳相似性系數(shù)最大,達(dá)到了0.94,可以認(rèn)為YC13-554和YC13-559為所構(gòu)建的擬近等基因系中最優(yōu)近等基因系,可作為高含油量/低含油量近等基因系在遺傳研究中應(yīng)用。

2.3 近等基因系農(nóng)藝性狀分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)近等基因系構(gòu)建結(jié)果,2015年收獲前對(duì)YC13-554、YC13-559這2個(gè)近等基因系進(jìn)行了農(nóng)藝性狀的單株調(diào)查分析,每份試材在成熟期取10株進(jìn)行田間調(diào)查和考種分析,其結(jié)果列于表 3。

表3 農(nóng)藝性狀分析

從表3可以看出,試材YC13-554和YC13-559 的各農(nóng)藝性狀表現(xiàn)基本一致,沒有明顯差異,證明近等基因系的選育成功,可以用于今后對(duì)調(diào)控油菜含油量的相關(guān)基因進(jìn)行研究。

3 討論

近等基因系的構(gòu)建方法有回交法、突變體中篩選等。自1988年Young等[12]和 Muehlbauer等[13]提出近等基因系以來,近等基因系在甘藍(lán)型油菜研究中已有應(yīng)用[14]。張潔夫等[15]利用雜交高代自交系構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜無花瓣近等基因系;甘莉等[16]利用回交轉(zhuǎn)育的方法構(gòu)建了抗(耐)菌核病的油菜近等基因系材料。筆者利用連續(xù)自交的方法成功構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜含油量的近等基因系,這是一種可行的構(gòu)建近等基因系的方法,豐富了近等基因系的選育方法,為后續(xù)對(duì)油菜含油量的相關(guān)基因研究提供了優(yōu)異的種質(zhì)材料。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性遺傳、覆蓋整個(gè)基因組、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),因此,被普遍應(yīng)用在遺傳多樣性的研究領(lǐng)域,例如Piquemal等[17]利用240對(duì)SSR引物構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜遺傳圖譜;陳勛等[18]利用42對(duì)SSR引物對(duì)59個(gè)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行分析,比較了春性和半冬性甘藍(lán)型油菜的遺傳差異。龍衛(wèi)華等[19]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)油菜MI細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因近等基因系進(jìn)行了鑒定。為了驗(yàn)證所構(gòu)建的近等基因系,選擇了SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)所構(gòu)建的擬近等基因系進(jìn)行了近等性分析,確定出YC13-554和YC13-559這2個(gè)近等基因系。研究結(jié)果還說明,利用SSR分子標(biāo)記與農(nóng)藝性狀相結(jié)合的方法鑒定近等基因系,是一種簡單有效的鑒定方法。

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Construction and Identification of Near-isogenic Lines of High/Low Oil Content inBrassicanapusL.

LIU Zijun1,XIAN Shuanshi2,WANG Yaohui1,FAN Jianchun2,WANG Jingxue1,DU Chunfang2

(1.College of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.Cotton Research Institute,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Yuncheng 044000,China)

To explore the mechanism of regulation of fatty acid metabolism,find valuable high oil genes and provide based material for high quality breeding inBrassicanapusL.,the near-isogenic lines of high/low oil content was constructed.After continuous self crossing two generations,30 sister lines with same agronomic traits and different oil content were chosen based on high oil line,NJ9.Final nine near-isogenic line were obtained.156 pairs of SSR primers derived fromBrassicaDB public databases were used for PCR amplification of nine protocol near-isogenic line meterials,and 32 pairs of primers were screened for near-isogenic analysis.The results of genetic similarity coefficient estimation and clustering analysis,based on PCR amplification result,showed that the genetic similarity coefficients of 9 candidate strains were between 0.85 and 0.94,and the genetic similarity coefficient of YC13-554 and YC13-559 was 0.94,which was identified as near isogenic line.Based on the results of the investigation and analysis of agronomic traits in the mature period,the YC13-559 and YC13-554 were identified as high oil content and low oil near isogenic line.This study proves that using the method of continuos self cross and directional selection could be used to build nearly-isogenic lines and enriched the resource of nearly-isogenic lines.

BrassicanapusL.;Near-isogenic line;Near-isogenic analysis;SSR molecular marker;Genetic similarity coefficient

2016-05-20

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311010-4)

劉紫君(1992-),女,山西沁水人,在讀碩士,主要從事植物分子生物學(xué)研究。

王景雪(1961-),女,山西新絳人,教授,博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

杜春芳(1974-),女,山西芮城人,副研究員,博士，主要從事油菜遺傳育種研究。

S56

A

1000-7091(2016)05-0129-05

10.7668/hbnxb.2016.05.019