陳 婷,方和娣,李 霄,李冠英,譚小力,張志燕,王 政

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

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甘藍(lán)型油菜BnMPK3的序列分析及其對(duì)環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)

陳 婷,方和娣,李 霄,李冠英,譚小力,張志燕,王 政

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

為了分析油菜MAP激酶3對(duì)各種環(huán)境脅迫信號(hào)的表達(dá)響應(yīng),以甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)為試材,采用同源克隆法克隆了甘藍(lán)型油菜MAP激酶3基因(BnMPK3)的cDNA序列。序列分析表明,BnMPK3編碼一條370個(gè)氨基酸殘基的蛋白序列,這個(gè)序列含有1個(gè)高度保守的TEY磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)CD錨定區(qū)域,與AtMPK3的序列相似性達(dá)到94%。煙草瞬時(shí)表達(dá)分析顯示,BnMPK3是1個(gè)細(xì)胞核定位蛋白;熒光定量PCR分析顯示,BnMPK3在莖以及花和葉組織器官中特異性表達(dá),并且對(duì)NaCl溶液、4 ℃低溫、PEG溶液和K2Cr2O7溶液以及甲基茉莉酸(MeJA)和乙烯前體(ACC)等的處理顯著上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明,BnMPK3是高鹽、低溫、干旱、重金屬以及JA和ET等各種環(huán)境脅迫因子的響應(yīng)基因,建議BnMPK3可能在調(diào)控油菜對(duì)各種環(huán)境脅迫防御的過(guò)程中位于JA和ET相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中,數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步研究BnMPK3在油菜抗逆中的功能及其機(jī)制提供理論線索。

甘藍(lán)型油菜;BnMPK3;表達(dá)響應(yīng);環(huán)境脅迫

在外界環(huán)境的脅迫壓力下,植物進(jìn)化發(fā)展出了一系列信號(hào)應(yīng)答系統(tǒng)來(lái)感知環(huán)境信號(hào)并做出反應(yīng),其中,絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activited protein kinases,MAPKs)在植物對(duì)各種環(huán)境信號(hào)進(jìn)行應(yīng)答的過(guò)程中起著重要的作用[1]。MAPKs是一類絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶,在各種真核生物中廣泛存在,與上游的MAPKK和MAPKKK等激酶組成MAPK級(jí)聯(lián)途徑(MAPK cascades),參與激素反應(yīng)、脅迫應(yīng)答、細(xì)胞分化和發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程[2-3],在應(yīng)對(duì)冷、干旱、鹽、環(huán)境污染以及病原體侵害等多種非生物和生物脅迫方面具有重要作用[4]。

全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn),模式生物擬南芥基因組含有20個(gè)MAPKs。根據(jù)保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域TxY(MAPKKs磷酸化MAPKs的位點(diǎn)),這20個(gè)MAPKs可被分為A～D 4組,其中,A、B和C 3組為TEY亞型,D組為TDY亞型[5-6]。研究顯示,包含有擬南芥AtMPK3和AtMPK6及其直系同源物的A組MAPKs,主要參與一些環(huán)境和激素反應(yīng)。如煙草的SIPK作為AtMPK6的同源物被證明是一種水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶,在環(huán)境脅迫的壓力反應(yīng)中可以被激活[7];苜蓿的SIMK也參與對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)[8];MPK3及其同源物同樣也可被環(huán)境壓力誘導(dǎo)表達(dá)。如,擬南芥AtMPK3蛋白可被氧化脅迫激活[9],而其煙草同源物WIPK參與傷信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7],在苜蓿中,其同源物SAMK參與各種生物和非生物脅迫反應(yīng)[10]。B組的MAPKs以擬南芥的MPK4和MPK11為代表,主要參與對(duì)病原菌的防御以及一些非生物逆境的響應(yīng)[11-13];目前有關(guān)C、D組的研究還比較少。

油菜(BrassicanapusL.)作為我國(guó)最重要的油料作物在種植過(guò)程中經(jīng)常受到各種外界環(huán)境脅迫的影響,從而嚴(yán)重地影響油菜的生產(chǎn)。本試驗(yàn)以我國(guó)長(zhǎng)江中下游油菜主產(chǎn)區(qū)廣泛種植的具有優(yōu)良抗逆特點(diǎn)的甘藍(lán)型油菜品種中雙9號(hào)為試材,采用分子克隆的方法克隆獲得了1個(gè)油菜MAPK-BnMPK3基因序列,然后探究這個(gè)基因的蛋白亞細(xì)胞定位及其組織特異性表達(dá),最后調(diào)查這個(gè)基因在各種環(huán)境脅迫和激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)響應(yīng)情況。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

甘藍(lán)型油菜品種中雙9號(hào)、本氏煙草(Nicotianatabacumcv.Xanthinc)、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) 菌株LBA4404、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α均來(lái)自江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院503實(shí)驗(yàn)室。

水楊酸(Salicylic acid,SA)購(gòu)于華東化玻有限公司(CAS No:616-76-2);甲基茉莉酸(Methyl jasmonate,MeJA) 購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司(cat No.39,270-7);脫落酸(Abscisic acid,ABA)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(Cat.No.A4906);乙烯前體ACC(1-Aminocyclopropane carboxylic acid,ACC)購(gòu)于Adamas Reagent公司(CAS No:22059-21-8);2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 植株培養(yǎng)

油菜和煙草培養(yǎng)在溫室條件下,光周期為光照條件(25 ℃)16 h,黑暗條件(20 ℃)8 h,相對(duì)濕度60%～90%。

1.3 總RNA 的提取及cDNA的制備選取

取少量植物葉片(不超過(guò)1 g),在液氮中研磨充分后加入到裝有1 mL TRIzol試劑的無(wú)菌EP管中,葉片總RNA提取按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行操作。提取得到的總RNA溶于20 μL DEPC處理過(guò)的無(wú)菌水中,從中取出0.2 μL溶于5 μL DEPC水中進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,RNA濃度測(cè)定使用OneDrop OD-1000+分光光度計(jì)。RNA的逆轉(zhuǎn)錄先用DNase Ⅰ 去除基因組DNA,然后按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,最后得到總體積21 μL的cDNA溶液,分裝后置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 序列克隆

根據(jù)NCBI上公布的甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)MPK3(BoMPK3,Gene ID:106334002)的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆,PCR引物序列為:F:5′-GGTACCTCTT CTCATTTCAGTCCCTCA-3′ 和R:5′-GGATCCGGATA TTTAGCCATTCATTCG-3′。擴(kuò)增條件為:94 ℃ 10 min;然后94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 30 s,最后72 ℃延伸10 min,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增得到的目的片段使用GenClean 柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后連接到pMD19-T Vector上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌。PCR鑒定平板上的單菌落,將鑒定得到的陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒后送往上海生工進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序成功后命名為pMD19T-BnMPK3。

1.5 序列分析和比對(duì)

ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/) 用于分析上述擴(kuò)增得到的序列的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)和分子質(zhì)量;使用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)[14]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況;GeneDoc軟件用于多序列比對(duì)分析。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

1.6.1 用于亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建 以上述構(gòu)建的pMD19T-BnMPK3載體提取的質(zhì)粒作為模板,設(shè)計(jì)PCR引物F:5′-GGTACCTCTTCTCATTTCAGTCCC TCA-3′ 和R:5′-GGATCCGGATATTTAGCCATTCAT TCG-3′,擴(kuò)增完成后收集去除終止子的目的條帶。按Gate-way試劑盒操作說(shuō)明,取一定量的目的片段與pENTRY載體反應(yīng),得到入門克隆,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選,選取平板上長(zhǎng)出的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),菌液PCR鑒定目的片段是否與pENTRY載體連接成功。取測(cè)序成功的菌液提取質(zhì)粒,與植物表達(dá)載體pK7FWG2.0-eGFP的質(zhì)粒進(jìn)行LR反應(yīng),該過(guò)程依據(jù)Gateway LR反應(yīng)試劑盒程序操作,LR反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,PCR鑒定單菌落,將得到的陽(yáng)性克隆命名為pK7FWG2.0-BnMPK3-eGFP。將該陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒取適量導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。菌種置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 分別培養(yǎng)含有P19 (一種抑制基因沉默的蛋白質(zhì))、PCX-IND-DsRed (攜帶紅色熒光蛋白的核定位Marker基因構(gòu)成的載體) 和pK7FWG2.0-BnMPK3-eGFP的農(nóng)桿菌,培養(yǎng)至OD600值為0.6時(shí)收集菌體,用MAA溶液洗2次,最后調(diào)節(jié)其OD600值為1.2,28 ℃誘導(dǎo)2～4 h。使用去掉針頭的無(wú)菌注射器吸取菌液,緊貼煙草葉片下表皮將菌液緩慢注入葉片,直到整片葉片都充滿菌液為止。將煙草置于不透光的密封箱內(nèi),保濕培養(yǎng)一晝夜,然后置于光下培養(yǎng)5 d后觀察。以空載體pK7FWG2.0-eGFP、PCX-IND-DsRed和P19的混合菌液為對(duì)照。該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 熒光共聚焦顯微鏡的觀察 葉片注射5 d后,用熒光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)觀察并檢測(cè)熒光信號(hào)。綠色熒光GFP的激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm,紅色熒光DsRED的激發(fā)光波長(zhǎng)為543 nm,2種熒光的發(fā)射波長(zhǎng)分別為510～540 nm,580～584 nm。

1.7 模擬環(huán)境脅迫和激素的化學(xué)處理

選用油菜四葉一心期的油菜幼苗,將幼苗從土壤中取出后用水洗干凈,再將其轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),并在黑暗條件下48 h后進(jìn)行不同環(huán)境脅迫模擬處理。

干旱脅迫處理:用聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)溶液模擬干旱,將預(yù)處理的油菜置于配置好的濃度15%的PEG4000溶液,黑暗下20 ℃培養(yǎng);鹽脅迫處理:將預(yù)處理的油菜置于配置的400 mmol/L的NaCl溶液中黑暗培養(yǎng);重金屬(鉻)脅迫處理:將預(yù)處理的油菜置于配置好的500 μmol/L的K2Cr2O7溶液中20 ℃黑暗培養(yǎng);低溫脅迫處理:取預(yù)處理的油菜置于另一100 mL 1/2 MS培養(yǎng)基,將其置于4 ℃冰箱中黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。激素的化學(xué)處理:取預(yù)處理后的大小基本相同的葉片,等量放入4個(gè)不同的塑料密封箱中,整齊鋪開后分別用1 mmol/L SA (水楊酸)、0.1 mmol/L MeJA(甲基茉莉酸)、0.05 mmol/L ABA(脫落酸)和0.1 mmol/L ACC(乙烯前體)溶液噴灑葉片,對(duì)照噴灑滅菌雙蒸水,置于不透光的密封箱內(nèi)保濕處理,處理0,3,6,9,12 h后分別將葉片取出裝袋,標(biāo)記好后迅速置于液氮中,隨后立即轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱凍存。上述每種處理均需進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 定量RT-PCR

采用2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒,內(nèi)參基因選用B.napusUBC21(BnUBC21,油菜數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào):Bra009857),設(shè)計(jì)的引物為:F:5′-CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT-3′;R:5′-CATATCTC CCCTGTCTTGAAATGC-3′;BnMPK3基因熒光定量PCR的引物序列為:F:5′-ACCAGGGCTTGTCTGAG GA-3′和R:5′-AATCGCAGTTGGCGTTCA-3′。熒光定量反應(yīng)體系根據(jù)2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒的說(shuō)明書配置。擴(kuò)增條件中設(shè)置退火溫度為60 ℃,反應(yīng)40個(gè)循環(huán);在每個(gè)循環(huán)的72 ℃復(fù)性末端收集熒光信號(hào),通過(guò)每一個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)的變化得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。每組試驗(yàn)均要進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù),同時(shí)每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少需要進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)處理:根據(jù)數(shù)據(jù)輸出后得到的BnUBC21和BnMPK3的Ct值,用2-ΔΔCt計(jì)算法將Ct值轉(zhuǎn)化為基因的相對(duì)表達(dá)量,將0 h(未處理時(shí))或根(Roots)的表達(dá)量轉(zhuǎn)換為1,進(jìn)而計(jì)算其相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)量變化[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜BnMPK3的克隆及其序列分析

同源克隆根據(jù)甘藍(lán)MPK3(BrassicaoleraceaMPK3,BoMPK3)的核苷酸序列CDS區(qū)的外側(cè)設(shè)計(jì)上下游引物,以油菜品種中雙9號(hào)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得單一的1 299 bp的擴(kuò)增片段。該序列中ORF框從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG,長(zhǎng)1 113 bp,編碼的蛋白質(zhì)含有370個(gè)氨基酸殘基(圖1);使用MeGa 5軟件進(jìn)行多種氨基酸序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn),這個(gè)目的條帶與雙子葉植物甘藍(lán)、擬南芥、煙草、苜蓿和單子葉植物玉米、水稻、小麥等7個(gè)物種的MAPK在氨基酸水平上有很高的同源性,與AtMPK3的一致性達(dá)到94%(圖2)。與其他植物的MPK3類似,BnMPK3作為一類MAPKs含有1個(gè)保守的氨基酸基序TEY,是MAPKKs對(duì)其磷酸化的位點(diǎn),并且在BnMPK3的碳末端區(qū)域含有1個(gè)MAPKKs錨定位點(diǎn)的保守結(jié)構(gòu)域。因此,這個(gè)基因是MPK3在油菜中的同源基因即BrassicanapusMPK3(BnMPK3)。

黑色陰影標(biāo)記為擴(kuò)增序列所用的上下游引物；灰色表示起始密碼子和終止密碼子。

Bn.油菜;Bo.甘藍(lán);At.擬南芥;WIPK.煙草傷誘導(dǎo)蛋白激酶;Ms.苜蓿;Zm.玉米;Os.水稻;Ta.小麥；Ⅰ～Ⅺ表示11個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；TEY為保守的TEY磷酸化位點(diǎn)；CD-domain表示CD錨定區(qū)。

Bn.Brassicanapus;Bo.Brassicaoleracea;At.Arabidopsisthaliana;WIPK.Wound-induced protein kinase;Ms.Medicagosativa;Zm.Zeamays;Os.Oryzasativa;Ta.Triticumaestivum。Ⅰ-Ⅺ represents eleven conserved domains;TEY means conserved TEY phosphorylation site;CD-domain represents CD anchorage zone.

圖2 BnMPK3與其他物種的氨基酸序列比對(duì)及其序列分析

Fig.2 Sequence analysis of BnMPK3 and multiple sequence alignment

2.2 BnMPK3的亞細(xì)胞定位和組織特異性表達(dá)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)使BnMPK3蛋白在煙草中得以快速高效表達(dá),用于探究BnMPK3的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示(圖3-A),轉(zhuǎn)化pK7FWG2.0-BnMPK3-eGFP的煙草葉片的細(xì)胞在綠色熒光激發(fā)下細(xì)胞核顯示為綠色,而在紅色激發(fā)光下轉(zhuǎn)化PCX-IND-DsRed(融合RFP的細(xì)胞核定位標(biāo)志基因)的細(xì)胞核顯紅色,當(dāng)2個(gè)視野重疊后則顯黃色,這一結(jié)果表明BnMPK3定位于細(xì)胞核中。

為了調(diào)查BnMPK3的組織特異性表達(dá),使用qRT-PCR技術(shù)分析BnMPK3在根、莖、葉、花、種子等組織器官中的相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果表明,BnMPK3在根、莖、葉、花、種子中都有表達(dá),但在莖中表達(dá)最為顯著,在葉和花中次之,在根和種子中表達(dá)最少(圖3-B)。

a.核定位標(biāo)志基因蛋白質(zhì)融合紅色熒光蛋白R(shí)FP;b.BnMPK3融合綠色熒光蛋白GFP;c.a和b重疊。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和0 h之間的表達(dá)差異程度用*(P<0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)表示。

a.Nuclear localization marker gene protein fused with red fluorescent protein;b.BnMPK3 fused with green fluorescent protein;c.Overlap of a and b.The level of expression differences between each time point and 0 h used*(P<0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.001) to represent.

圖3BnMPK3的亞細(xì)胞定位和組織特異性表達(dá) (A.亞細(xì)胞定位;B.組織特異性表達(dá))

Fig.3 Subcellular localization and tissue-specific expression ofBnMPK3(A.Subcellular localization;B.Tissue-specific expression)

2.3 各種環(huán)境因子對(duì)BnMPK3表達(dá)的影響

為了調(diào)查BnMPK3在高鹽、低溫、干旱、重金屬各種環(huán)境脅迫下的表達(dá)情況,分別用NaCl溶液、4 ℃低溫、PEG溶液(模擬干旱)和K2Cr2O7溶液處理甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)。qRT-PCR分析顯示(圖4),在NaCl溶液處理1 h時(shí)BnMPK3的表達(dá)量達(dá)到處理前的4.67倍;在4 ℃低溫處理下BnMPK3的表達(dá)也快速上調(diào)。同時(shí),在PEG溶液和K2Cr2O7溶液處理的條件下,BnMPK3的表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)改變。這些結(jié)果表明,BnMPK3是高鹽、低溫、干旱、重金屬等各種環(huán)境脅迫因子的響應(yīng)基因。

hpt.處理后小時(shí)數(shù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和0 h之間的顯著性差異程度用***(P<0.001)、**(P<0.01)和*(P<0.05)表示。圖5同。

hpt.Hours post treatment;The level of expression differences between each time point and 0 h used***(P<0.001),**(P<0.01)和*(P<0.05) to represent.The same as Fig.5.

圖4BnMPK3對(duì)各種環(huán)境脅迫因子的表達(dá)響應(yīng)

Fig.4 Expression responses ofBnMPK3 to various environmental stress factors

2.4 各種植物激素對(duì)BnMPK3表達(dá)的影響

大量的研究顯示,水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、乙烯(ET)等植物激素在調(diào)控植物防御各種環(huán)境脅迫中起著重要的作用。在用這些植物激素或其類似物處理甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)后,qRT-PCR分析結(jié)果顯示,MeJA和ACC(ET的前體)處理后BnMPK3的表達(dá)量有顯著變化;而SA和ABA處理后,BnMPK3沒有顯著響應(yīng)表達(dá)(圖5)。試驗(yàn)結(jié)果表明,BnMPK3是激素JA和ET的響應(yīng)因子,建議BnMPK3可能在調(diào)控植物防御各種環(huán)境脅迫中,參與到JA和ET相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中。

圖5 BnMPK3對(duì)各種激素處理的表達(dá)響應(yīng)

3 討論

油菜是我國(guó)主要的油料作物,在種植過(guò)程中會(huì)受到各種環(huán)境脅迫的影響,嚴(yán)重影響油菜的生產(chǎn)。大量的研究表明,MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在植物感受胞外環(huán)境脅迫刺激從而在胞內(nèi)啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)的過(guò)程中起著重要的介導(dǎo)作用[11,16]。然而,在甘藍(lán)型油菜中,關(guān)于MAPK在植物抗逆過(guò)程中的參與情況及其重要性仍然未被充分闡述。本試驗(yàn)以我國(guó)長(zhǎng)江中下游油菜主產(chǎn)區(qū)廣泛種植的具有優(yōu)良抗逆特點(diǎn)的甘藍(lán)型油菜品種中雙9號(hào)為試材,克隆了1個(gè)重要的MAP激酶基因-BnMPK3,并系統(tǒng)地分析了其在各種環(huán)境因子脅迫下的表達(dá)響應(yīng),鑒定出BnMPK3是高鹽、低溫、干旱、重金屬以及JA和ET等各種環(huán)境脅迫因子的響應(yīng)基因。

目前,各種MPK3同源基因已經(jīng)從其他多種植物中克隆,并且對(duì)其展開了環(huán)境脅迫響應(yīng)表達(dá)研究。在擬南芥中,AtMAPK3可以被低溫和高鹽激活[17];在花生(Arachishypogaea)中,低溫脅迫可以顯著誘導(dǎo)AhMPK3 的表達(dá)[18];而在棉花(Gossypiumbarbadense)中,GbMPK3除了可以被低溫、高熱(42 ℃)和脫水誘導(dǎo)表達(dá)之外,對(duì)高鹽卻表現(xiàn)出極端響應(yīng)[19]。在試驗(yàn)中,進(jìn)行系統(tǒng)地調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,BnMPK3不僅是低溫、干旱等環(huán)境因子的響應(yīng)基因,而且當(dāng)用高鹽處理時(shí),BnMPK3做出快速響應(yīng),1 h內(nèi)其表達(dá)量達(dá)到處理前的4.67倍。這些研究結(jié)果共同指出MPK3是各種環(huán)境脅迫因子的響應(yīng)基因,表明在生物學(xué)功能上這些MPK3同源基因具有一定的保守性。另外,本研究首次調(diào)查了MPK3對(duì)鎘離子(Cr3+)污染的響應(yīng)表達(dá),并且顯示出,BnMPK3是Cr3+脅迫的響應(yīng)基因,這為進(jìn)一步研究植物對(duì)重金屬污染的防衛(wèi)策略提供了線索。

植物對(duì)外界環(huán)境脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)的調(diào)控機(jī)制是復(fù)雜的。脫落酸(ABA)被認(rèn)為是植物對(duì)非生物脅迫(如干旱)做出反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子[20-21],然而,最近的研究顯示,表現(xiàn)為提高干旱耐受性的GbMPK3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草,在模擬干旱處理時(shí),體內(nèi)ABA的含量并不提高,建議GbMPK3在介導(dǎo)煙草抵御干旱脅迫的過(guò)程中獨(dú)立于ABA信號(hào)途徑[19];在本研究中,BnMPK3在ABA以及SA處理時(shí)并無(wú)顯著的表達(dá)響應(yīng),而是對(duì)JA和ET的處理強(qiáng)烈表達(dá)響應(yīng);與本研究結(jié)論類似的是,在水稻中,OsMPK3可以被JA處理誘導(dǎo)表達(dá)但是對(duì)SA處理沒有顯著表達(dá)響應(yīng),進(jìn)而這個(gè)基因的沉默降低了JA的積累[22]。同樣,在長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)植物中,MeJA(甲基茉莉酸)處理顯著誘導(dǎo)CrMPK3的表達(dá)[23]。因此,建議BnMPK3在調(diào)控植物對(duì)各種環(huán)境脅迫防御的過(guò)程中可能位于JA和ET相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中,本研究的數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步研究BnMPK3在油菜抗逆中的功能及其機(jī)制提供試驗(yàn)線索。

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Sequence Analysis ofBrassicanapusMAP Kinase 3 and It′s Expression Responses to Environmental Signals

CHEN Ting,FANG Hedi,LI Xiao,LI Guanying,TAN Xiaoli,ZHANG Zhiyan,WANG Zheng

(Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

In order to explore the effect of environment signals on the expression of MPK3 in oilseed rape,a full length cDNA ofBrassicanapusMPK3 (BnMPK3) was cloned from the cv.Zhongshuang No.9 by homology cloning approach.Sequence analysis showed that BnMPK3 contained a highly conserved motif TEY and a CD domain (common docking domain) and was consisted of 370 amino acid residues exhibiting 94% identity with AtMPK3.Transient expression assays in tobacco showed that BnMPK3 is localized in nuclei.Quantitative RT-PCR analysis showed thatBnMPK3 was especially expressed in stems,flowers and leaves and revealed that its expression was significantly up-regulated by the treatments with NaCl solution,4 ℃,PEG4000 solution,K2Cr2O7solution or MeJA,ACC solution.The results demonstrated thatBnMPK3 was a response gene involved in responses to various environmental stresses including high-salinity,low temperature,drought and heavy metal pollution and to signaling molecules JA and ET,suggesting thatBnMPK3 may involve in JA and ET signaling pathways in defense response against various environmental stresses in oilseed rape,which will provide useful information in further in-depth functional analysis ofBnMPK3 in defense to environmental stresses.

Brassicanapus;BnMPK3;Expression responses;Environmental stresses

2016-07-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31071672);江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(09JDG061)

陳 婷(1991-),女,江蘇蘇州人,在讀碩士,主要從事油菜功能基因組學(xué)研究。

王 政(1974-),男,內(nèi)蒙古包頭人,副研究員,博士,主要從事油菜功能基因組學(xué)研究。

S565.4;Q78

A

1000-7091(2016)05-0094-07

10.7668/hbnxb.2016.05.014