張秀秀,黃萬龍,郭云濤,苗向陽

(中國農業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

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ssc-miR-486靶基因預測及生物信息學分析

張秀秀,黃萬龍,郭云濤,苗向陽

(中國農業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

通過對ssc-miR-486進行靶基因預測及生物信息學分析,以探索其影響豬脂肪沉積的作用機制。首先利用實時熒光定量PCR技術對脂肪沉積能力相差較大的萊蕪豬和大白豬皮下脂肪組織中ssc-miR-486表達情況進行比較研究,然后利用miRBase、Ensembl、NCBI等數(shù)據(jù)庫及miRanda、PITA、RNAhybrid、Cytoscape、JASPAR、Promoter Scan等軟件對ssc-miR-486進行生物信息學分析,包括保守性分析、轉錄因子結合位點預測、靶基因預測、GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。結果表明,ssc-miR-486在脂肪沉積能力較強的萊蕪豬皮下脂肪組織中發(fā)生顯著上調。生物信息學分析結果發(fā)現(xiàn),miR-486在各物種間非常保守,ssc-miR-486啟動子區(qū)域有SREBP1、SREBP2等多個轉錄因子結合位點,獲得的229個靶基因顯著富集于脂質代謝、脂質生物合成、細胞代謝等生物學過程及類固醇生物合成、磷脂肌醇代謝、PPAR等信號轉導通路中。結果表明,ssc-miR-486參與了豬脂肪沉積或脂肪代謝的調控,為今后研究脂肪沉積提供基礎理論支撐。

ssc-miR-486;生物信息學;脂肪沉積;豬

肥胖是一種代謝綜合征,是當今全球侵蝕人類健康的常發(fā)病之一。目前,肥胖已經成為重要的世界性健康問題,據(jù)保守估計,大約有50%人口處于超重狀態(tài),而且,在未來的幾年里,肥胖的人數(shù)將達到7億[1-2]。此外,肥胖并發(fā)癥比如心腦血管疾病、二型糖尿病、胰島素抵抗、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等的發(fā)病率在逐年升高,明顯地增加了全球的發(fā)病率和死亡率[1-3],因此闡明肥胖發(fā)生的機制,制定有效的治療方案已迫在眉睫。研究表明，脂肪組織不僅是能量儲存器官,而且是機體重要的調節(jié)能量平衡的內分泌器官,它可以產生和分泌多種生物活性肽,即脂肪因子,參與葡萄糖和脂質代謝、能量平衡、成脂分化、血管功能等多個生物學過程的調控[4],脂肪組織功能紊亂會導致肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生[5-6],因此脂肪組織是主要治療肥胖的靶標。

脂肪組織功能受到pRB-E2F、MAPK、PPAR、WNT等重要信號通路以及SREBPS、C/EBPS和PPARγ等關鍵轉錄因子的嚴格調控,此外，近年來越來越多的研究證明microRNA(miRNA)在成脂分化和脂代謝中也發(fā)揮了重要作用。miRNA 是一種長為18～22 nt的內源性非編碼RNA,在細胞內由70～80 nt的單鏈RNA前體經Dicer酶剪切加工而來,廣泛存在于植物、線蟲和哺乳動物細胞中,具有高度的進化保守性[7],它可通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)互補配對,引起靶基因mRNA降解或轉錄后翻譯抑制,從而對基因表達進行轉錄后調控[8-10],在動物細胞的增殖、分化、凋亡和代謝等許多生物學過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。2003年,Xu等[14]在研究果蠅時發(fā)現(xiàn)miR-14參與了三?；视秃投；视退降恼{節(jié),自此miRNA對脂代謝的調控作用受到了關注,2004年,Esau等[15]發(fā)現(xiàn)miR-143可以通過靶基因MAP2K5促進脂肪細胞分化,自此第1個影響脂肪細胞分化的miRNA被鑒定出來,隨后一系列的調控脂代謝及成脂分化的miRNAs陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),例如miR-103促進了成脂分化[16],let-7和miR-27家族抑制了成脂分化[17-19],miR-33調控了脂肪酸、甘油三脂和膽固醇的穩(wěn)態(tài)等[20-22]。本試驗利用生物信息學對另外1個在萊蕪豬皮下脂肪組織中發(fā)生顯著上調的miRNA-ssc-miR-486進行了功能研究,豬是人類疾病研究的醫(yī)學模型,在脂肪沉積的很多方面與人類相似[23],故研究ssc-miR-486在豬脂肪組織中的調控作用,不僅有助于豬的肉質改善,更有望為治療肥胖提供有用信息。

miR-486是由Fu等[24]在2005年利用人的胎肝組織研究miRNA鑒定方法時首次鑒定并注冊的5種新miRNA之一,目前關于miR-486的研究多集中在肺癌、肝癌、大腸癌、胃癌等癌癥的研究中,然而近來miR-486在脂肪組織中的功能也逐漸受到了研究者們的關注。Prats-Puig等[25]對肥胖和正常兒童進行循環(huán)miRNA表達譜比較研究時發(fā)現(xiàn),在肥胖兒童的血清中miR-486的濃度顯著高于對照組,而且其濃度的指標與體重指數(shù)及其他的肥胖指數(shù)例如體脂率、區(qū)域性脂肪分布等密切相關,表明血清中miR-486的表達異常是青春期前肥胖的1個重要生物標志。此外,Liu等[26]通過熒光素酶報告和轉染試驗證明miR-486通過靶向HAT1阻礙了ABCA1介導的膽固醇外流,從而促進了巨噬細胞中膽固醇的積累,增加了動脈粥樣硬化的發(fā)生率?；蚺c細胞工程實驗室前期對不同脂肪沉積能力的萊蕪豬和大白豬的皮下組織小RNA進行高通量測序,結果發(fā)現(xiàn)ssc-miR-486在脂肪沉積能力較強的萊蕪豬中發(fā)生了顯著上調,qPCR也驗證了這一點?；谝陨习l(fā)現(xiàn),推測miR-486可能是一個潛在的參與調控脂肪沉積的重要miRNA。目前,最權威的miRBase數(shù)據(jù)庫對ssc-miR-486的功能沒有注釋,miR-486對豬脂肪沉積的影響機制尚不清楚,因此,本試驗主要利用生物信息學方法對miR-486在脂肪沉積中的功能進行進一步探索和挖掘,為ssc-miR-486在豬脂肪沉積中的研究提供理論指導,為治療人類脂肪疾病提供潛在的靶點。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以萊蕪市大千農牧有限公司萊蕪豬場的萊蕪豬和大白豬作為試驗材料,選取在相同條件下飼養(yǎng)的萊蕪豬和大白豬各3頭。屠宰后取相同部位的皮下脂肪組織,迅速放于1.8 mL的凍存管中,并立即投入液氮速凍,然后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 qPCR檢測兩品種豬皮下脂肪組織中ssc-miR-486的表達變化

利用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取皮下脂肪組織各樣本的總RNA,檢測總RNA的質量和完整性,檢驗合格后用SG One-Step miRNA RT Kit試劑盒合成cDNA,試驗操作按產品說明書進行。以cDNA為模板,在Step One PLUS熒光定量PCR儀(ABI,美國)中進行qPCR試驗,每個物種3個重復,反應體系為15 μL:2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O補至15 μL。反應條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸15 s,45個循環(huán);PCR產物溶解曲線的反應條件:95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。引物為5′-TCCTGTACTGAGCTGCCCCGAGTT-3′,由北京信諾金達生物科技有限公司合成。以U6為內參基因,利用2-ΔΔCt計算ssc-miR-486的相對表達量,GraphPad Prism5統(tǒng)計軟件對ssc-miR-486在不同樣本中的相對表達量進行統(tǒng)計分析(t-test),數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤(mean±SE)”表示。

1.3 ssc-miR-486生物信息學分析

1.3.1 ssc-miR-486轉錄因子結合位點(TFBS)預測 在Ensemble數(shù)據(jù)庫中檢索出ssc-miR-486的1條前體,再利用NCBI數(shù)據(jù)庫檢索到其另外1條前體,取它們上游2 kb的序列,利用JASPAR CORE Vertebrate(http://jaspardev.genereg.net)和Scan Version 1.7(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/) 2個在線預測軟件對ssc-miR-486進行TFBS預測。

1.3.2 miR-486保守性分析 從miRBase(Release 21;http://www.mirbase.org/) 中檢索出豬(Susscrofa, Ssc)、人(Homosapiens,Hsa)、牛(Bostaurus,Bta)、大猩猩(Gorillagorilla,Ggo)、獼猴(Macacamulatta,Mml)、黑猩猩(Pantroglodytes,Ptr)、婆羅州猩猩(Pongopygmaeus,Ppy)、灰倉鼠(Cricetulusgriseus,Cgr)、大鼠(Rattusnorvegicus,Rno)、小鼠(Musmusculus,Mmu)、馬(Equuscaballus,Eca)的miR-486序列,分析其保守性。

1.3.3 ssc-miR-486靶基因的預測 為了探索ssc-miR-486的生物學功能,從Ensemble數(shù)據(jù)庫中提取豬所有基因的3′UTR序列,在Linux系統(tǒng)下利用miRanda(http://www.microrna.org/micro rna/getDownloads.do)、PITA(http://genie.Weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07data.html)、RNAhybrid(http://bibiserv.Tec hfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) 3種軟件對ssc-miR-486進行靶基因的預測,并取三者預測結果的交集,然后結合文獻中報道m(xù)iR-486的靶基因,共同組成ssc-miR-486的靶基因集合用于后續(xù)的進一步分析。

1.3.4 Gene Ontology分析 采用Cytoscape的插件BINGO(http://www.cytoscape.org/)對靶基因進行功能富集分析,Cytoscape 是1個開源的生物信息學處理軟件,可用于生物分子、基因等的信息整合,并實現(xiàn)分子互作網(wǎng)絡的可視化,而BINGO可實現(xiàn)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中很大一部分功能,如基因的GO注釋層次分類及富集分析等。從Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(www.geneontology.org)中下載最新的豬的GO Ontology注釋信息,利用BINGO對 ssc-miR-486預測的靶基因集合進行基于生物學過程(Biological process,BP)、細胞組分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)3個層面的GO注釋分析,并利用超幾何分析檢驗法進行統(tǒng)計學分析,利用Benjamini-Hochberg算法進行校正,得到顯著富集的GO Terms(corrP-value<0.05)。

1.3.5 KEGG Pathway分析 Cytoscape的另1個插件ClueGO是Bindea等[27]開發(fā)的1個可以進行基因功能注釋分析,并以圖表和網(wǎng)絡的形式展現(xiàn)分類注釋條目的生物信息學平臺,該插件可以隨時更新數(shù)據(jù)庫,保證基因注釋的全面性。利用ClueGO對ssc-miR-486靶基因集合進行基于KEGG的Pathway富集分析,通過超幾何分析檢驗法進行統(tǒng)計學分析,利用Benjamini-Hochberg算法進行校正,得到顯著富集的Pathways(corrP-value<0.05),再基于Kappa值將功能相近的Pathways分為1組,以圖表和網(wǎng)絡的形式呈現(xiàn)(Kappa≥0.3)。

2 結果與分析

2.1 qRT-PCR結果

qRT-PCR結果如圖1所示,產生的擴增曲線是“S”型,溶解曲線只有單一峰,說明ssc-miR-486可以進行特異性擴增,數(shù)據(jù)經GraphPad Prism5統(tǒng)計軟件分析后發(fā)現(xiàn),ssc-miR-486在萊蕪豬皮下脂肪組織中的表達量極顯著高于在大白豬中的表達量(P<0.000 1),萊蕪豬是脂肪沉積能力較強的豬種,而大白豬是典型的瘦肉型豬種,故推測ssc-miR-486可能促進了豬的脂肪沉積。后續(xù)對ssc-miR-486進行生物信息學分析,以進一步探索和挖掘其功能。

2.2 TFBS預測結果

使用2種在線軟件分別對2條ssc-miR-486前體(表1)的上游2 kb區(qū)域TFBS進行預測,發(fā)現(xiàn)它們的啟動子區(qū)域有增強子激活結合蛋白2(Activating enhancer binding protein 2,AP-2)、轉錄因子SP1(Sp1 transcription factor,SP1)、CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha,CEBPα)、CCAAT/增強子結合蛋白β(CCAAT/enhancer-binding protein beta,CEBPβ)、膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1(Sterol-regulatory element binding protein1,SREBP1)、膽固醇調節(jié)元件結合蛋白2(Sterol-regulatory element binding protein2,SREBP2)、轉錄因子SOX17(SOX17 Transcription factor,SOX17)、成肌分化因子1(Myogenic differentiation 1,MYOD1)等多個轉錄因子結合位點(圖2-A),其中SP1、C/EBPα、C/EBPβ、SREBP1、SREBP2均參與了脂肪細胞分化及脂肪代謝的調節(jié)。

A.ssc-miR-486的擴增曲線;B.ssc-miR-486的溶解曲線;C.ssc-miR-486在兩品種豬皮下脂肪組織中的差異表達;L.萊蕪豬,D.大白豬。

名稱Name登錄號AccessionNo.染色體Chromosome位置/bpLocation長度/bpLengthssc-mir-486-1NC_0104591712191266～1219134580ssc-mir-486-2ENSSSCG000000228071712191229～1219131082

2.3 保守性分析

應用miRBase數(shù)據(jù)庫檢索豬在內的共11個物種的miR-486成熟序列進行分析,結果如表2所示,miR-486序列在各物種中高度保守。

表2 不同物種miR-486成熟序列

2.4 靶基因預測結果

取miRanda、PITA及RNAhybrid 3種軟件預測結果的交集,共得219個基因(圖2-B),再結合文獻中已報道的miR-486的10個靶基因,共計獲得ssc-miR-486的靶基因為229個,作為后續(xù)功能注釋的靶基因集合,如表3所示。

2.5 GO分析結果

針對以上229個靶基因進行GO注釋分類和富集分析,結果顯示(表4-6),在生物學過程(BP)層面,ssc-miR-486的靶基因主要顯著富集于脂質代謝、脂質生物合成、細胞脂質代謝及磷脂代謝等與脂類代謝相關的GO條目中(corrP-value<0.05),在細胞組分(CC)層面,靶基因顯著富集于細胞質、胞內組分、膜性細胞器及脂粒等GO條目中(corrP-value<0.05),在分子功能(MF)層面,靶基因富集于酰基轉移酶活性、類固醇激素受體活性等條目中(0.050.05,富集于MF層面的條目可能具有假陽性。

A.ssc-miR-486與其轉錄因子的作用關系圖:三角代表轉錄因子,圓形代表ssc-miR-486;B.3種靶基因預測軟件對ssc-miR-486靶基因的預測結果。

表3 ssc-miR-486的部分靶標基因

2.6 KEGG富集結果

為了進一步探索ssc-miR-486的功能,在GO注釋的基礎上,利用ClueGO對229個靶基因進行KEGG通路富集分析,結果如圖3所示,靶基因顯著富集于9個生物學通路中,其中包括類固醇生物合成、磷酸肌醇代謝、磷脂酰肌醇信號通路、鞘磷脂信號轉導通路、PPAR信號通路、p53信號通路、Fc gamma R 介導的細胞吞噬作用、非小細胞肺癌、mTOR信號轉導通路。基于Kappa值,磷酸肌醇代謝與磷脂酰肌醇信號通路被分為一組,其他7個通路各為一組(Kappa≥0.3)(圖3-B)。其中前4組均是與脂質代謝相關的通路,故推測ssc-miR-486可能參與了脂質代謝的調控。

表4 ssc-miR-486 靶基因在生物學過程(BP)層面富集結果

表5 ssc-miR-486 靶基因在細胞組分(CC)層面富集結果

表6 ssc-miR-486 靶基因在分子功能(MF)層面富集結果

A.9個顯著富集的KEGG pathways:*.靶基因顯著富集的Pathways(corrP-value<0.05),**.靶基因極顯著富集的Pathways(corrP-value<0.01);B.基于Kappa值,根據(jù)功能注釋進行分組的Pathways:9個通路,共分為了8組(Kappa≥0.3);C.富集通路的網(wǎng)絡圖:大節(jié)點代表通路,小節(jié)點代表富集到該通路中的靶基因。

A.9 significantly enriched KEGG Pathways:*.Significantly enriched pathways of target genes(corrP-value<0.05),**.Highly significantly enriched pathways of target genes(corrP-value<0.01);B.Accoding to the functional annotation of pathways,9 KEGG pathways were divided into 8 groups based on their Kappa score level(Kappa≥0.3);C.The network of enriched pathways:the big nodes mean pathways,and the smaller nodes mean target genes enriched in these pathways.

圖3 ssc-miR-486靶基因的 KEGG富集結果

Fig.3 KEGG enrichment results of ssc-miR-486 predicted target genes

3 討論與結論

目前隨著對miRNA研究的日益深入,越來越多的miRNA被鑒定出來,但是仍有很多miRNAs的功能是未知的,miRNA功能的實現(xiàn)往往比較復雜,比如上游的轉錄因子和下游的靶基因與miRNA共同組成1個調控網(wǎng)絡參與生物學過程的調節(jié),此外,1個miRNA可能作用于多個靶基因,多個miRNA也可能作用于1個靶基因,因此面對龐大數(shù)量的miRNAs功能的研究,只是利用試驗的方法,已經變得相當困難,再加上高通量技術的應用和發(fā)展,大量的miRNAs被鑒定出來[28-30],為miRNA功能的探索和挖掘帶來了挑戰(zhàn)。生物信息學作為新興起的學科,可以對海量和復雜的信息進行分析和處理,為下一步試驗提供指導,在miRNA研究中扮演著非常重要的角色。本試驗主要利用生物信息學方法研究和探索ssc-miR-486在豬脂肪沉積及脂代謝中發(fā)揮的作用,以期為后續(xù)的試驗提供數(shù)據(jù)支持。首先利用qRF-PCR技術對萊蕪豬和大白豬皮下脂肪組織中ssc-miR-486的表達量進行比較,結果發(fā)現(xiàn)其在萊蕪豬中顯著上調,推測其促進了豬的脂肪沉積,為了進一步挖掘ssc-miR-486潛在的生物學功能,通過生物信息學方法對ssc-miR-486進行轉錄因子結合位點預測、同源性和進化分析、靶基因預測及對靶基因進行功能富集分析和信號轉導通路富集分析,以了解ssc-miR-486可能的轉錄因子調控位點、進化關系及其參與調控的生物學過程和信號通路,進而對其在豬脂肪沉積中的作用進行探索。MiRanda、RNAhybrid、PITA是目前比較常用的3種可以實現(xiàn)本地化操作的靶基因預測軟件,下載豬所有基因的3′UTR區(qū),利用這3種軟件在本地完成了ssc-miR-486靶基因的預測,再取3種軟件預測結果的交集,減少了假陽性,保證了靶基因預測的準確性。此外，在進行后續(xù)功能分析之前,綜合了近幾年來關于miR-486研究中確定的靶標作為后續(xù)分析的靶基因集合,靶基因預測是進行miRNA功能研究的基礎,采用上述策略鑒定出的靶基因保證了后續(xù)功能分析的全面性和可靠性。

為了揭示ssc-miR-486在豬脂肪沉積中的作用,本試驗對預測的靶基因集進行GO注釋分析和KEGG生物通路富集分析,利用的分析軟件分別是Cytoscape的插件BINGO和ClueGO,Cytoscape[31]是1款開源的生物信息學軟件,可用于高通量表達數(shù)據(jù)及其他生物分子交互作用信息的整合及分子交互網(wǎng)絡的可視化,此外可以利用自身以及第三方開發(fā)的大量功能插件,實現(xiàn)差異基因及分子的功能注釋。BINGO與ClueGO分別完成靶基因的GO Ontology分析和KEGG Pathway分析,這2款插件與其他的功能注釋軟件相比,最大的優(yōu)勢在于它們可以隨時更新GO Ontology和KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫,保證注釋信息的全面性,這對于注釋信息相對不完善的豬來說,具有更大的優(yōu)勢。ssc-miR-486靶基因集的GO注釋主要顯著富集在了脂質代謝、脂質生物合成、細胞脂質代謝等生物學過程中,由此推測ssc-miR-486在豬的脂質代謝中發(fā)揮重要作用。KEGG分析結果顯示，ssc-miR-486靶基因顯著富集在類固醇生物合成、磷酸肌醇代謝、鞘磷脂信號轉導通路、PPAR信號通路、非小細胞肺癌信號通路等9個信號轉導通路中。類固醇是廣泛分布于生物界的一大類環(huán)戊稠全氫化菲衍生物的總稱,包括固醇(如膽固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麥角固醇),膽汁酸和膽汁醇等,鞘磷脂是機體內兩大類磷脂之一,磷酸肌醇是1種酸性磷脂,大約占細胞磷脂的8%。ssc-miR-486通過靶向作用于信號通路中的靶基因改變了類固醇生物合成、磷酸肌醇代謝等通路的信號轉導,參與了這些脂質的生物合成及代謝。

PPAR信號通路也是1條關鍵的與脂肪酸代謝、固醇代謝以及成脂分化相關的通路[32],該通路中的核心元件PPARs是一類由配體激活的核轉錄因子,可以被脂肪酸及其派生物激活,屬于受體超家族成員,最早由Isseman和Green從小鼠肝臟中克隆得到[33],目前已發(fā)現(xiàn)有PPARα、PPARβ和PPARγ 3種亞型[34],其中,PPARα在肝臟、心臟、腎臟及大部分的動脈血管細胞中高水平表達,具有調節(jié)脂質和脂蛋白代謝,緩和動脈粥樣硬化及降低血漿中三酰甘油含量等功能。PPARβ幾乎在全身所有組織中都有較高的表達,目前,有關PPARβ的研究報道較少。而PPARγ在脂肪組織中的表達最豐富,是核心的調控脂代謝和脂肪細胞分化的轉錄因子[35-37]。此外,RXR(視黃醇X受體)也是PPAR信號通路中的核心元件,當PPARs被上游的脂肪酸等配體激活后,RXR與其結合形成異二聚體,然后通過與位于脂代謝或成脂分化相關基因上游的特異性DNA反應元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE)結合而調控基因表達[38],從而完成整個信號通路的信號轉導,實現(xiàn)了對下游脂代謝、脂肪細胞分化等生物學功能的調控。

ssc-miR-486通過靶向RXRB、ACSBG1等基因參與了PPAR通路的信號轉導,其中RXRB屬于視黃醇X受體基因,ACSBG1(?；o酶A合成酶口膠家族成員 1)屬于PPAR通路中PPARs作用的下游靶基因。Keller等[39]利用凝膠阻滯和共轉染試驗證明PPARα可以與RXRB形成異二聚體,然后共同激活乙酰輔酶A氧化酶基因的表達,促進脂肪酸的β-氧化。ACSBG1是ACSBG家族中的成員,又稱長鏈?；o酶 A 合成酶,催化脂肪酸轉變?yōu)橄鄳闹舅彷o酶 A 派生物,促進脂肪酸氧化分解,Wang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，甲福明可以增加小鼠C2C12細胞中脂肪酸氧化相關基因PPARD、ACSBG1等的表達,從而促進脂肪酸氧化,抑制了C2C12細胞中脂肪的沉積。因此,RXRB與ACSBG1均是可以促進脂肪酸氧化,抑制脂肪沉積的基因,推測ssc-miR-486通過靶向抑制PPAR信號通路中的這2個基因,抑制了脂肪酸的分解代謝,從而促進了豬的脂肪的沉積,這與ssc-miR-486在脂肪沉積能力較強的萊蕪豬中發(fā)生顯著上調的現(xiàn)象是一致的。

轉錄因子結合位點預測發(fā)現(xiàn)ssc-miR-486啟動子區(qū)域有C/EBPα、C/EBPβ、SREBP1、SREBP2等轉錄因子的結合位點,SREBPs是脂類代謝調節(jié)中的一個關鍵轉錄因子,其中SREBP1可以激活參與脂肪酸、磷脂和甘油三酯合成的基因FASN、SCD、ACC的表達[41-43],SREBP2調控了參與膽固醇合成和攝取的基因如HMGCR、LDLR和HMGCS的表達[44]。C/EBPα是脂肪細胞分化的關鍵基因[45-46],C/EBPβ在脂肪細胞分化的早期表達,通過作用于C/EBPα和PPARγ啟動子上的C/EBP調節(jié)元件激活它們的表達,從而調節(jié)下游成脂分化標記基因例如FABP4、LPL、FAS、GLUT4等的表達,使脂肪細胞進入終末分化階段[47-48]。由此可知C/EBPα、C/EBPβ、SREBP1、SREBP2是調節(jié)脂肪細胞分化和脂代謝的關鍵轉錄因子,它們作用于ssc-miR-486編碼基因的啟動子,可能會對ssc-miR-486調控豬脂代謝或脂肪細胞分化產生影響。

本試驗預測得到的靶基因還需要進一步的試驗驗證。此外,與人、大鼠、小鼠、牛等物種相比,數(shù)據(jù)庫中豬的注釋信息相對較少,對ssc-miR-486靶基因的功能注釋相對局限,故隨著對豬研究的不斷深入,豬的注釋信息會不斷完善,那么ssc-miR-486的功能就有待進一步分析和闡明?？傊?本試驗主要利用生物信息學的方法,對ssc-miR-486進行轉錄因子、GO、KEGG Pathway等方面的分析,探索了ssc-miR-486在豬脂肪沉積、成脂分化、脂代謝等方面的調控功能,挖掘出了SREBPs等多種轉錄因子,RXRB、ACSBG1等關鍵靶基因以及PPAR等重要信號通路。為今后有關ssc-miR-486的后續(xù)研究提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論指導。

ssc-miR-486受到SREBPs、C/EBPs等多個轉錄因子的調控,它可能通過靶向類固醇生物合成、鞘磷脂信號轉導通路、磷酸肌醇代謝、PPAR信號通路中的靶基因影響這些通路的信號轉導,進而參與了豬的脂肪沉積及成脂分化的調控。

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Target Gene Prediction and Bioinformatics Analysis of ssc-miR-486

ZHANG Xiuxiu,HUANG Wanlong,GUO Yuntao,MIAO Xiangyang

(Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

The target gene prediction and bioinformatics analysis of ssc-miR-486 were performed to explore its effects on the porcine fat deposition.First,the Real-time PCR was applied to detect differential expression of ssc-miR-486 in the subcutaneous adipose tissue of Laiwu pig and Large White pig which were quite different in terms of fat deposition capability.Then we performed bioinformatics analysis of ssc-miR-486 including the prediction of the target genes and transcription factor binding sites,the analysis of sequence conservation and involved Gene Ontology and KEGG pathway of its target genes using the databases such as miRBase,Ensembl and NCBI and bioinformatic softwares such as miRanda,PITA,RNAhybrid,Cytoscape,JASPAR and Promoter Scan.ssc-miR-486 was significantly upregulated in the subcutaneous adipose tissue of Laiwu pig with easily fat accumulation.The bioinformatics analysis showed that miR-486 was very conservative among various species and multiple transcription factor binding sites such as SREBP1and SREBP2 were predicted in the promoter area of ssc-miR-486.Additionally the obtained 229 target genes of ssc-miR-486 were significantly enriched in many biological processes,for example lipid metabolism,lipid biosynthesis and cell metabolism,et al and signal transduction pathways such as steroid biosynthesis,inositol phospholipid metabolism and PPAR signaling pathway.The results suggest that ssc-miR-486 plays a certain role in fat deposition and lipid metabolism of pigs and provide a basis for fat deposition research in the future.

ssc-miR-486;Bioinformatics;Fat deposition;Pig

2016-07-21

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2009ZX08008-004B;2008ZX08008-003);國家“863”計劃項目(2008AA10Z140);國家自然科學基金項目(30571339);中國農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新項目(ASTIP-IAS05);國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”計劃項目)(2015CB943100);中國農業(yè)科學院創(chuàng)新基金項目(2004-院-1);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2013ywf-yb-5;2013ywf-zd-2)

張秀秀(1989-),女,山西大同人,碩士,主要從事分子育種研究。

苗向陽(1963-),男,山東萊州人,研究員,博士,博士生導師,主要從事基因工程和功能基因組學及分子育種研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0062-09

10.7668/hbnxb.2016.05.010