馬小軍,陳富強,張小麗,李發(fā)弟,唐 然,張 晨,宋曉育,張 欣

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

?

金黃色葡萄球菌對小尾寒羊乳腺組織TLR2表達的影響

馬小軍1,2,陳富強1,張小麗1,李發(fā)弟3,唐 然1,張 晨1,宋曉育1,張 欣1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

Toll樣受體能夠識別細菌等病原微生物及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)信號通路，在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。為了解Toll樣受體2(TLR2) 在小尾寒羊正常乳腺組織及由金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎乳腺組織中的表達情況,探討TLR2在金黃色葡萄球菌乳腺炎致病過程中的作用機制及乳腺上皮細胞在乳腺免疫防御中所起的作用,采用qRT-PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色(IHC)法檢測了正常小尾寒羊及金黃色葡萄球菌乳腺炎病理模型小尾寒羊乳腺組織中TLR2基因mRNA及其蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,小尾寒羊正常乳腺組織、金黃色葡萄球菌感染乳腺組織均有TLR2 mRNA及其蛋白表達;但金黃色葡萄球菌感染后乳腺組織中TLR2基因及TLR2蛋白顯著高于正常乳腺組織,且感染后48 hTLR2 mRNA和TLR2蛋白相對表達量最高(P<0.05),96 hTLR2 mRNA和蛋白相對表達量較48 h顯著降低(P<0.05),正常對照組TLR2的相對表達量最低。通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),正常乳腺組織中TLR2蛋白主要定位于乳腺腺泡上皮,而感染金黃色葡萄球菌后乳腺組織中TLR2蛋白主要表達在乳腺腺泡腔中脫落的乳腺上皮細胞和以淋巴細胞為主的炎性細胞上。結(jié)果表明,乳腺感染金黃色葡萄球菌后,乳腺上皮細胞是病原菌作用的靶標(biāo),通過上調(diào)表達TLR2識別病原菌,激發(fā)先天免疫。

金黃色葡萄球菌;小尾寒羊;乳腺炎;Toll樣受體2基因(TLR2)

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是一種典型的革蘭氏陽性病原菌,可引起多種嚴重感染,也是引起動物慢性、亞臨床型及臨床型乳腺炎的重要病原菌之一。小尾寒羊(Small-tail han sheep)是我國肉裘兼用型綿羊品種,以其多胎、多羔、生長快、體格大、遺傳性穩(wěn)定和適應(yīng)性強等優(yōu)點,成為我國發(fā)展肉羊生產(chǎn)或培育雜交肉羊品種的優(yōu)良母本素材[1]。但目前的舍飼條件基礎(chǔ)設(shè)施薄弱、飼養(yǎng)密度較高、經(jīng)營管理粗放,很容易導(dǎo)致乳腺炎的產(chǎn)生。乳腺炎能造成飼料的浪費和藥費的增加,影響羔羊健康、生長發(fā)育,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是1997年 Medzhitov等[2]率先報道的人類一種同源于果蠅Toll的蛋白分子,屬于Ⅰ型跨膜蛋白,是在許多感染性疾病中識別入侵病原微生物、介導(dǎo)固有免疫細胞活化的重要模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs),是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分[3-4]。TLRs作為模式識別受體,可識別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs),激活細胞信號傳導(dǎo)途徑,觸發(fā)天然免疫,并通過提供刺激分子和誘導(dǎo)T細胞分化的細胞因子建立獲得性免疫[5]。目前,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類 Toll樣受體家族至少有11個成員,已經(jīng)鑒定出綿羊有10種TLR(TLR1～TLR10)[6-7]。TLRs與天然免疫應(yīng)答關(guān)系的研究中,倍受關(guān)注的是TLR2和TLR4。其中Toll樣受體2(Toll-like receptor,TLR2)具有相對廣泛的配體特異性,包括G+菌的肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LAT)、G-菌的類脂A、G-菌脂蛋白(BLP)、酵母細胞壁等[8]。

近年來,Toll樣受體在人和鼠上的研究已經(jīng)取得了較大的進展,雖然家畜TLRs對病原的天然免疫識別及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)已成為一個研究熱點,但目前對于家畜TLRs的研究大多集中在TLRs基因的克隆及序列分析、TLRs基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性的研究、TLRs在組織中的分布等方面[9-10],而對TLRs在家畜疾病中作用機制的研究尚處于起步階段,尤其是對TLRs在牛、羊乳腺炎發(fā)病過程中的作用機制的研究更少。本試驗通過金黃色葡萄球菌人工感染小尾寒羊建立乳腺炎病理模型,利用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法檢測小尾寒羊正常乳腺組織和感染金黃色葡萄球菌后不同時間乳腺組織中TLR2在mRNA水平和蛋白水平的表達情況及TLR2的表達部位,為深入探究金黃色葡萄球菌與小尾寒羊乳腺細胞的相互作用以及葡萄球菌引起的乳腺炎在分子水平上的發(fā)病機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

TRIzol(Invitrogen,美國)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,美國)、實時熒光定量PCR試劑盒(Roche,瑞士),免疫組化所用Rabbit Anti-TLR2多克隆抗體和SP-0023通用型二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和APES防脫玻片(ZLI-9502)從北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司購買。常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀為Funglyn Biotech FTC-3000,顯微照相裝置(DP71)為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 試驗材料

將正處于泌乳中期的健康小尾寒羊(年齡2～3歲,體重36～40 kg)9只隨機分為3組,正常對照組和試驗Ⅰ組(感染48 h)和試驗Ⅱ組(感染96 h),每組3只,試驗組小尾寒羊一側(cè)乳頭管中注入0.5 mL(3×106cfu/mL)金黃色葡萄球菌(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)課題組以從患臨床型乳腺炎的哺乳期綿羊乳汁中分離并鑒定保存)菌懸液,灌注后輕柔按摩,使其分布均勻;對照組注射等量的生理鹽水,成功建立小尾寒羊乳腺炎模型。于接菌后48,96 h每只羊分別無菌手術(shù)采集乳腺組織各2份,一份浸泡于福爾馬林溶液中供組織切片制作,一份立即放入液氮后于-80 ℃冰箱中保存供RNA提取。

1.3 引物的設(shè)計與合成

從GenBank選取綿羊TLR2基因和內(nèi)參基因β-actin的mRNA序列,采用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計引物(表1)。

1.4 乳腺組織總RNA提取

小尾寒羊乳腺組織總RNA提取按照TRIzol試劑說明書操作步驟進行,采用瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測提取的總RNA質(zhì)量和純度,保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 qRT-PCR引物基本信息

1.5 RT-PCR擴增

根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書操作要求進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,采用20 μL反應(yīng)體系:總RNA 2.0 μL,Oligo(dT)15Primer 1.5 μL,Random Primer 1.5 μL,70 ℃ 5 min后立即放置冰上至少5 min后,加入GoScriptTM5X Reaction Buffer 4.0 μL,MgCl23.0 μL,PCR Nucleotide Mix 1.0 μL,Recombinant RNasin?Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL,GoScriptTMReverse Transcriptase 1.0 μL,Nuclease-Free Water 5.5 μL,25 ℃反應(yīng)5 min,42 ℃溫浴1 h;以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板,用設(shè)計的特異性引物擴增目的基因,采用25 μL反應(yīng)體系:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,RT反應(yīng)產(chǎn)物2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,去離子水8.5 μL;PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min預(yù)變性;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。同時將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳,進行成像分析。

1.6 qRT-PCR檢測TLR2的表達

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA(2 μL)為模板進行定量PCR擴增,每個時間的樣品做3個重復(fù),PCR反應(yīng)體系(20 μL)如下:FastStart SYBR Green Master 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,去離子水7 μL;PCR擴增按三步法反應(yīng)條件進行:50 ℃ 2 min,95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,55 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,40個循環(huán),同時記錄擴增曲線和溶解曲線。內(nèi)參基因為β-actin,重復(fù)次數(shù)n=3,采用2-ΔΔCt分析TLR2基因相對表達量,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.7 乳腺組織免疫組織化學(xué)染色

采集的乳腺組織標(biāo)本用4%中性福爾馬林溶液固定后,進行石蠟包埋,制備4 μm厚的切片備用。組織切片用60 ℃烘烤2 h后進行免疫組化學(xué)SP染色,再進行脫蠟、酒精梯度分化;切片經(jīng)30 g/L H2O2水溶液封閉過氧化物酶10 min、健康羊血清白蛋白孵育15 min后,滴加50 μL Rabbit Anti-TLR2多克隆抗體(稀釋度1∶200),37 ℃孵育2 h,用PBS洗滌后滴加50 μL生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液,再加50 μL HRP標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,37 ℃孵育;滴加配制DAB顯色液,脫水透明、封片。用顯微照相系統(tǒng)照相觀察。每張組織切片隨機選取5個視野(400倍),用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析,測定獲得TLR2蛋白陽性反應(yīng)物的平均光密度值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺組織總RNA提取結(jié)果

提取的乳腺組織總RNA,用微量紫外分光光度計(波長260,280 nm)檢測其的質(zhì)量和純度,各乳腺組織總RNA的A260/280在1.9～2.0,表明提取的RNA純度較高;經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,乳腺組織總RNA的28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3條帶完整,可用于下一步反應(yīng)(圖1)。

圖1 乳腺組織總RNA

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.β-actin的RT-PCR擴增

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR擴增內(nèi)參基因β-actin和TLR2基因,對PCR產(chǎn)物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果分別在107,172 bp左右處出現(xiàn)明顯的條帶,獲得預(yù)期分子量電泳條帶(圖2)。

圖3 內(nèi)參基因β-actin和TLR2基因熒光定量溶解曲線

2.3 qRT-PCR檢測TLR2基因在小尾寒羊乳腺組織中的表達

利用Funglyn Biotech FTC-300熒光定量PCR系統(tǒng)對TLR2基因和β-actin內(nèi)參基因進行擴增,qRT-PCR擴增40個循環(huán)后,根據(jù)擴增效率曲線判斷擴增效果良好,通過溶解曲線分析,內(nèi)參基因β-actin和TLR2基因分別在81.4,81.8 ℃出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰(圖3),均與設(shè)計的引物預(yù)期產(chǎn)物溫度接近。

結(jié)果顯示,與正常對照組相比,小尾寒羊乳房感染金黃色葡萄球菌48,96 h后其乳腺組織中TLR2 mRNA相對表達量均顯著增高(圖4)。在感染后48 h時乳腺組織中TLR2 mRNA相對表達量最高;感染后96 h時TLR2 mRNA相對表達量較48 h顯著下降,但仍然顯著高于對照組。以上結(jié)果表明,小尾寒

羊感染金黃色葡萄球菌后,其乳腺組織中TLR2基因 mRNA的表達量明顯上調(diào)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

A、B、C、a、b、c.免疫組織化學(xué)染色,其中a、b、c分別為圖A、B和C的陰性對照；A、a.正常對照組;B、b.感染后48 h組;C、c.感染后96 h組;△.TLR2陽性表達；免疫組織化學(xué)染色陽性產(chǎn)物呈棕褐色表達,表示有該蛋白的分布。

A,B,C,a,b and c are immunohistochemistry staining photos and a,b and c as negative controls of A，B and C;A,a.Normal control;B,b.After infection 48 h group;C,c.After infection 96 h group;△.TLR2 positive expression；The positive expression of immunohistochemical staining is brown which repre-sents the distribution of the protein.

圖5 免疫組織化學(xué)檢測乳腺組織中TLR2的表達(×400)

Fig.5 The expression ofTLR2 in breast tissue by immunohistochemistry magnification(×400)

2.4 TLR2蛋白在小尾寒羊乳腺組織中的表達及分布檢測

小尾寒羊乳腺組織免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)陽性產(chǎn)物呈棕褐色,試驗結(jié)果顯示,正常乳腺組織中TLR2蛋白主要定位于乳腺腺泡上皮,感染金黃色葡萄球菌后的乳腺組織中TLR2蛋白主要表達在乳腺腺泡腔中脫落的乳腺上皮細胞和以淋巴細胞為主的炎性細胞上(圖5)。

乳腺組織中TLR2的陽性表達用圖像分析軟件進行分析,測定出其平均光密度值。結(jié)果表明,感染金黃色葡萄球菌后48 h組小尾寒羊乳腺組織中TLR2蛋白陽性表達最強烈,并且與對照組和感染后96 h組相比,其陽性表達量顯著增強;感染后96 h組小尾寒羊乳腺組織中TLR2蛋白表達量較感染后48h組顯著降低,但與對照組相比,感染后96 h組TLR2蛋白的表達增加量不顯著(表2)。

表2 乳腺組織中TLR2陽性反應(yīng)的平均光密度

3 討論

TLRs為哺乳動物免疫提供關(guān)鍵組分,是最早應(yīng)答感染的免疫監(jiān)視機制的一部分[5],對乳腺的先天性免疫具有重要的作用。金黃色葡萄球菌的感染可能會導(dǎo)致嚴重的乳腺炎等疾病,其細胞壁成份,如脂蛋白(Lipoproteins,LPS)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)等都可以被TLR2所識別,激活TLR2級聯(lián)信號,觸發(fā)先天性免疫,進而激活獲得性免疫反應(yīng)[11]。TLR2 作為激動劑可以調(diào)節(jié)動物的免疫反應(yīng)并平衡 Th1/Th2 的表達[12]。TLR2 是奶牛乳腺炎抗性的候選基因,馬騰壑等[13]研究結(jié)果顯示,牛TLR2基因第2外顯子T到G的突變與其乳腺炎體細胞評分顯著相關(guān)。從而提示TLR2可能在宿主對乳房內(nèi)感染免疫應(yīng)答中起重要作用,但是具體的機制還不清楚,有待進一步深入研究。

TLR2 在動物的多個組織和器官表達,表達水平在不同組織有所不同。TLR2 分布在單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等細胞,也在肺泡上皮細胞、口腔上皮細胞、腸上皮細胞表達,在外周血的白細胞中高表達[14-15]。Tirumurugaan等[16]研究發(fā)現(xiàn),TLR1～TLR10在山羊淋巴結(jié)表達量高,TLR1～TLR9在外周血單個核細胞、肺臟表達量高,外周血單個核細胞、淋巴結(jié)、脾臟、空腸中TLR2的表達量較高,而在子宮、肺和皮膚細胞中TLR2表達量較低而TLR6表達量較高。最近的研究表明,TLR2、TLR4 和其下游信號通路的組分都能表達于牛乳腺上皮細胞中,乳腺上皮細胞能夠通過 Toll 樣受體途徑介導(dǎo)引發(fā)先天免疫反應(yīng),并對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌做出免疫反應(yīng)[ 17-19]。當(dāng)奶?；加须[型和臨床型乳腺炎,其血液白細胞TLR2表達量顯著高于健康奶牛[20]。Goldammer 等[21]發(fā)現(xiàn),牛患病乳區(qū)TLR2基因mRNA的表達量高于不患病乳區(qū)[21]。茹坤[22]研究發(fā)現(xiàn),用熱滅活的金黃色葡萄球菌對薩能奶山羊乳腺上皮細胞進行刺激,6 h后TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-8、TLR2 和 TLR4 表達量升高,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。本試驗研究結(jié)果表明,在正常小尾寒羊乳腺腺泡上皮細胞上就有少量TLR2蛋白表達,當(dāng)金黃色葡萄球菌感染時,小尾寒羊乳腺組織中TLR2蛋白的表達量顯著上調(diào),且TLR2主要表達在乳腺腺泡腔中脫落的乳腺上皮細胞和以淋巴細胞為主的炎性細胞上。上述研究結(jié)果說明金黃色葡萄球菌感染后,TLR2在局部的乳腺免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用,除了免疫細胞與入侵細菌直接相互作用外,乳腺上皮細胞在識別病原菌及其細胞壁成分,激發(fā)先天免疫的過程中起著重要的作用。

本試驗的研究結(jié)果還表明,雖然小尾寒羊乳腺組織中的TLR2基因及其產(chǎn)物的表達量在金黃色葡萄球菌感染后明顯上調(diào),但感染后48 h組小尾寒羊的TLR2 mRNA及TLR2的表達量均顯著高于對照組和感染后96 h組,說明金黃色葡萄球菌刺激小尾寒羊乳腺上皮細胞TLR2基因及其產(chǎn)物表達變化具有時間的依賴性,這為進一步探討金黃色葡萄球菌乳腺炎發(fā)生時乳腺上皮細胞TLR2基因及其表達產(chǎn)物的變化規(guī)律提供了研究基礎(chǔ),也為進一步探討金黃色葡萄球菌乳腺炎致病機理，研究乳腺上皮細胞在奶牛乳腺免疫防御中所起的作用提供了參考依據(jù)。

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Effect ofStaphyloccocusaureusonTLR2 Expression in Mammary Glands of Small-tail Han Sheep

MA Xiaojun1,2,CHEN Fuqiang1,ZHANG Xiaoli1,LI Fadi3,TANG Ran1,ZHANG Chen1,SONG Xiaoyu1,ZHANG Xin1

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu Province Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology,Lanzhou 730070,China;3.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Toll-like receptor (TLR) family plays a key role in innate immunity and various inflammatory responses,for recognizing the bacterial pathogen and mediated the signal path of inflammation.To investigate the expressions ofTLR2 in mammary glands of Small-tail han sheep were infected withStaphylococcusaureu, and to explore the mechanism of TLR2 in mastitis,the qRT-PCR and IHC technology was used to detect the expression ofTLR2 mRNA and TLR2 protein in the mammary gland of control and experimental groups.The results showed that theTLR2 mRNAs and protein were expressed in all mammary glands of Small-tail han sheep in control and experimental groups.The levels ofTLR2 mRNA and protein was lowest in control group,was highest at 48 h afterStaphylococcusaureuinfusion,significantly higher than that of control and 96 h group(P<0.05).After infected 96 h,the levels ofTLR2 mRNA and protein was significantly reduced than that of 48 h group(P<0.05).The protein of TLR2 were located in the epithelial cell of mammary gland acinus,were expressed in epithelial cell of mammary gland acinus dropped and inflammatory cells as lymphocytes after effectedStaphylococcusaureu.The results implied that the expression of TLR2 in the epithelial cell of mammary gland was up-regulated to recognize pathogenic bacteria,arouse the innate immunity.

Staphylococcusaureu;Small-tail han sheep;Mastitis;Toll-like receptors 2(TLR2)

2016-06-16

甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目;甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用與開發(fā)項目(GNSW-2011-22);甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院教研產(chǎn)學(xué)創(chuàng)新基金項目(GYCX-KX010)

馬小軍(1972-),男,甘肅涇川人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事動物免疫與抗病研究。

張小麗(1971-),女,甘肅定西人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事動物微生物免疫與抗病研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0050-06

10.7668/hbnxb.2016.05.008