劉炳旭，于鳳鳴，張立彬，武軍凱，宋立琴，肖 嘯，杜曉東

(1.河北科技師范學(xué)院 生命科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.河北科技師范學(xué)院 園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北 石家莊 050051)

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大果水晶梨褐色果皮突變體木質(zhì)素合成相關(guān)基因的組織特異性表達(dá)分析

劉炳旭1，于鳳鳴1，張立彬2，武軍凱2，宋立琴2，肖 嘯2，杜曉東3

(1.河北科技師范學(xué)院 生命科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.河北科技師范學(xué)院 園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北 石家莊 050051)

為研究木質(zhì)素合成相關(guān)基因(PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL)在大果水晶梨褐色果皮突變體中的表達(dá)特性，并為研究梨褐色果皮形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。按照RNA試劑盒法提取果皮、花、葉片、果肉、枝條韌皮部中總RNA；利用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物；使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究基因的表達(dá)。結(jié)果表明，PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL的最高相對表達(dá)量均出現(xiàn)在果皮中；果皮和果肉中POD的相對表達(dá)量極顯著高于其他基因，花、葉片和枝條韌皮部中CAD的相對表達(dá)量極顯著高于其他基因。綜上所述，大果水晶梨褐色果皮突變體木質(zhì)素合成相關(guān)的5個(gè)酶基因在果皮、果肉、葉片、花和枝條韌皮部中的表達(dá)具有明顯的組織特異性，這些基因可能與大果水晶梨褐色果皮的形成關(guān)系密切。

大果水晶梨褐色果皮突變體；木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶；基因；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；組織特異性表達(dá)

果實(shí)的果皮色澤是重要的農(nóng)藝性狀和商品外觀品質(zhì)之一，培育不同色澤果皮梨滿足不同消費(fèi)者的需求是梨育種的重要目標(biāo)之一。根據(jù)果皮的不同顏色，梨可以分為綠皮梨、褐皮梨和紅皮梨。歐洲國家多為紅皮梨，亞洲國家多為綠皮或褐皮梨。其中，砂梨主要有綠皮和褐皮兩大主群，一般情況下，成熟的砂梨多為褐皮梨。

大果水晶梨屬于砂梨系統(tǒng)，是1991年由韓國從新高梨(褐色果皮)選育的1個(gè)綠梨芽變品種。本課題組在綠皮的水晶梨中發(fā)現(xiàn)1個(gè)褐色果皮變異植株(圖1)，經(jīng)嫁接鑒定(圖2)，褐色變異性狀穩(wěn)定。

左.原品種；右.褐色突變體。

圖2 褐色突變體(左)嫁接在原品種(右)上

目前，對于梨褐色果皮形成，已有一些報(bào)道。張智濤等[1]研究發(fā)現(xiàn)，大果水晶梨褐色果皮突變體在果皮表面多覆蓋了一層木栓層，突變體果皮中木質(zhì)素的含量高于原品種。劉曉娜等[2]報(bào)道，木質(zhì)素是苯丙烷類代謝途徑中的次生代謝物，由苯丙烷代謝途徑中一些酶促反應(yīng)合成，其中，PAL、CAD、4CL、POD等是關(guān)鍵酶。李曉峰等[3]以碭山酥梨及其芽變品系銹酥為材料，研究果皮的褐色形成機(jī)理，發(fā)現(xiàn)銹酥果皮褐色形成與果皮中木質(zhì)素積累及相關(guān)酶活性提高有關(guān)，果皮中 CCoAOMT 的增量表達(dá)是銹酥果實(shí)褐皮形成的重要原因之一。盧曉鵬[4]以桂花和脆綠2個(gè)砂梨品種為研究對象，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素代謝途徑中的關(guān)鍵酶——肉桂酰輔酶A還原酶基因的表達(dá)與木質(zhì)素合成及石細(xì)胞形成相關(guān)。王新衛(wèi)[5]發(fā)現(xiàn)，褐皮黃花梨果皮中PpyPAL1和PpyCCR表達(dá)量顯著高于綠皮黃花梨果皮中的表達(dá)量。劉莉等[6]發(fā)現(xiàn)，銹酥(褐色果皮)果皮中木質(zhì)素增量與PAL2、4CL1、CAD1 和POD4酶基因表達(dá)量存在極顯著正相關(guān)性，PAL2、4CL1、CAD1 和POD4均參與了碭山酥梨與芽變銹酥果皮褐色的形成。本課題組李義紅等[7]也對大果水晶梨及其褐色果皮突變體的PAL酶進(jìn)行了基因克隆和定量表達(dá)分析研究等。由此可見，梨褐色果皮形成與木質(zhì)素合成密切相關(guān)，不同的試驗(yàn)材料，褐色果皮的形成原因也各不相同，但是，最終都影響了木質(zhì)素的合成。

本試驗(yàn)以大果水晶梨褐色果皮突變體試材，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已克隆的基因序列設(shè)計(jì)合成引物，利用QRT-PCR，將大果水晶梨褐色果皮突變體不同組織中與木質(zhì)素合成相關(guān)的5個(gè)酶基因的表達(dá)與內(nèi)參基因做相對定量，研究這些基因表達(dá)的組織特異性，為以后開展大果水晶梨褐色果皮形成機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014年6月12日(果實(shí)發(fā)育的幼果期)，從河北省撫寧縣代莊大果水晶梨園，分別取大果水晶梨褐色果皮突變體的果皮(不含果肉)、果肉、花、葉片(幼葉)、枝條(韌皮部)，經(jīng)液氮處理并混合均勻后，保存于 -80 ℃超低溫冰箱中，用于總RNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

利用實(shí)時(shí)熒光定量QRT-PCR方法，分析木質(zhì)素合成相關(guān)的5個(gè)酶基因在大果水晶梨褐色果皮突變體不同組織中的相對表達(dá)量。

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的基因序列，選擇不同于其他家族基因序列的特異區(qū)，利用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，選用Actin作為內(nèi)參，引物由中美泰和生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 cDNA 第一鏈的合成 不同組織RNA的提?。禾崛NA前，將所有玻璃容器、離心管和去離子水用焦炭酸二乙酯(DEPC)滅活RNase。稱取1 g的材料置于含液氮的研缽中充分研磨成粉末狀。按照RNA試劑盒提供的方法提取各個(gè)組織中的總RNA，采用非變性瓊脂糖凝膠電泳方法檢測總RNA的完整性。用核酸蛋白快速檢測儀( Eppendorf Biophotometer)測定RNA的純度( A260/280的值為1.8～2.0，說明RNA無污染)及濃度；用DEPC-ddH2O將RNA稀釋到下一步合成cDNA時(shí)所需模板的濃度1.0 μg/μL，未使用的RNA保存于 -80 ℃超低溫冰箱中備用。

表1 引物序列

去除基因組DNA:按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒提供的方法進(jìn)行操作，具體反應(yīng)體系見表2。

表2 去除基因組DNA反應(yīng)體系

上述試劑混合均勻后，于PCR儀上42 ℃保溫2 min。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒提供的方法進(jìn)行，具體反應(yīng)體系見表3。反應(yīng)液的配制在冰上操作。

輕柔混勻后，將反應(yīng)液置于PCR儀上，按照37 ℃，15 min；85 ℃ ，5 s的反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 定量表達(dá)分析 按照TaKaRa SYBR Premix EX Taq 試劑盒方法進(jìn)行操作。以Actin(GU830959)為內(nèi)參[8]。反應(yīng)采用兩步法，在ABI Step One 實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，40個(gè)循環(huán)。在60 ℃進(jìn)行熒光信號(hào)采集，反應(yīng)結(jié)束后生成融解曲線。

表3 反轉(zhuǎn)錄體系

大果水晶梨褐色果皮突變體不同組織的樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別對應(yīng)1個(gè)內(nèi)參，以ROX作為熒光校正，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Excel，Sigmaplot軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。利用ANOVA和LSD檢驗(yàn)對果皮、花、葉片、果肉、枝條韌皮部間PAL1、PAL2、POD、CAD、4CL基因的相對表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

用RNA試劑盒法分別提取了大果水晶梨褐色果皮突變體的果皮、花、葉片、果肉和枝條韌皮部中的總RNA，紫外檢測A260/280都在2.00左右。由于組織不同，RNA濃度在0.5～2.0 μg/μL。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，18SrRNA和28SrRNA條帶清晰(圖4)，說明提取的大果水晶梨褐色果皮突變體的5個(gè)組織的RNA完整性較好，可用于下一步反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

圖3 大果水晶梨褐色果皮突變體的

2.2 不同基因在不同組織中的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析大果水晶梨褐色果皮突變體果皮、花、葉片、果肉和枝條韌皮部中PAL1、PAL2、CAD、4CL、POD5個(gè)酶基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，5個(gè)基因在5個(gè)組織中均有表達(dá)，是組成型基因，但相對表達(dá)量各異(圖4)。

PAL1基因在果皮中的相對表達(dá)量最高，在果肉、花、枝條韌皮部、葉中依次降低(圖4-A)。PAL1在果皮中的相對表達(dá)量極顯著高于果肉、花、枝條韌皮部和葉；PAL1在果肉中的相對表達(dá)量極顯著高于葉，顯著高于花和枝條韌皮部，花和枝條韌皮部差異不顯著，但兩者均極顯著高于葉中的相對表達(dá)量。

PAL2基因在果皮中的相對表達(dá)量最高，在花、葉、枝條韌皮部、果肉中依次降低(圖4-B)。果皮PAL2相對表達(dá)量極顯著高于花、葉、枝條韌皮部和果肉；花中PAL2極顯著高于葉、枝條韌皮部和果肉；葉中PAL2極顯著高于果肉，但與枝條韌皮部差異不顯著；果肉和枝條韌皮部PAL2差異不顯著。

CAD基因在果皮中相對表達(dá)量最高，在果肉、葉、花、枝條韌皮部中依次降低(圖4-C)。果皮CAD相對表達(dá)量極顯著高于果肉、葉、花、枝條韌皮部；果肉、葉、花、枝條韌皮部CAD相對表達(dá)量差異不顯著。

POD基因在果皮中的相對表達(dá)量最高，在果肉、枝條韌皮部、葉、花中依次降低(圖4-D)。果皮POD相對表達(dá)量極顯著高于果肉、枝條韌皮部、葉、花；葉、花和枝條韌皮部POD差異不顯著，但三者均顯著低于果肉中的相對表達(dá)量。

4CL基因在果皮中的相對表達(dá)量最高，果肉、枝條韌皮部、葉、花依次降低(圖4-E)。果皮4CL基因的相對表達(dá)量極顯著高于果肉、枝條韌皮部、葉、花；果肉中4CL極顯著高于花，顯著高于葉，但與枝條韌皮部差異不顯著；枝條韌皮部中4CL顯著高于花，但與葉差異不顯著；葉和枝條韌皮部中4CL相對表達(dá)量差異不顯著。

相同組織中不同基因的相對表達(dá)量也有差異。果皮中，POD的相對表達(dá)量最高，CAD、PAL1、4CL、PAL2依次降低(圖4-F)。其中POD的相對表達(dá)量極顯著高于CAD、PAL1、4CL、PAL2；CAD顯著高于PAL1、4CL、PAL2；4CL和PAL1差異不顯著，但兩者均顯著高于PAL2的相對表達(dá)量。

花中CAD基因的相對表達(dá)量最高，PAL1、POD、PAL2、4CL依次降低(圖4-G)。CAD的相對表達(dá)量極顯著高于PAL1、POD、PAL2、4CL；POD和PAL1差異不顯著，但兩者均極顯著高于PAL2和4CL，而4CL和PAL2差異不顯著。

果肉中POD的相對表達(dá)量最高，CAD、PAL1、4CL、PAL2依次降低(圖4-H)。其中，POD極顯著高于CAD、PAL1、4CL、PAL2；CAD極顯著高于4CL、PAL2，顯著高于PAL1；PAL1、4CL、PAL2三者的相對表達(dá)量差異不顯著。

葉中CAD的相對表達(dá)量最高，POD、4CL、PAL1、PAL2依次降低(圖4-I)。其中POD、4CL、PAL1、PAL2差異不顯著，但均極顯著低于CAD的相對表達(dá)量。

枝條韌皮部中CAD的相對表達(dá)量最高，POD、PAL1、4CL、PAL2依次降低(圖4-J)。CAD相對表達(dá)量極顯著高于POD、PAL1、4CL、PAL2；POD、PAL1、4CL三者差異不顯著，但均極顯著高于PAL2的相對表達(dá)量。

3 討論與結(jié)論

植物PAL基因是1個(gè)多基因家族，通常為2～5個(gè)成員，來源不同的PAL具有不同的分子量和結(jié)構(gòu)[9]。一般情況下，不同植物的PAL活性不同，同一種植物不同部位PAL活性也不同[10]，通常PAL在幼嫩部位的活性比較高[11]。有殼和裸仁美洲南瓜PAL在葉片、莖、根、花瓣中均表達(dá)，在葉片和花瓣中的表達(dá)水平較高[12]；夏枯草PAL基因在莖、葉中均表達(dá)，在莖中的相對表達(dá)量高于葉的表達(dá)量[13]；在蝴蝶蘭葉片發(fā)育過程中，PAL基因的相對表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢[14]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大果水晶梨的PAL基因家族至少有2個(gè)成員，PAL1、PAL2基因在果皮中表達(dá)量最高，PAL2在果肉中表達(dá)量最低。這與上述植物在葉片中的表達(dá)量高的模式相同，可能功能相似。而PAL1在葉片中的表達(dá)量最低，與上述植物葉片中的表達(dá)量最高的模式不同，可能與物種不同有關(guān)。但PAL1與PAL2基因的表達(dá)模式不同，說明同一家族中的不同基因具有組織差異性，這與呂萌[15]的報(bào)道一致。

植物中4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)通常以家族形式存在，參與苯丙烷代謝途徑中不同代謝產(chǎn)物的合成，在植物組織中具有表達(dá)差異性。如：洋麻4CL基因在發(fā)育階段的所有組織中均有表達(dá)，在莖和根中的相對表達(dá)量最高，在葉和成熟的花中相對表達(dá)量最低[16]；煙草4CL1和4CL2基因在木質(zhì)部中的相對表達(dá)量最高，其次是韌皮部，在上部葉表達(dá)水平最低[17]；百合Ls4CL基因在莖中相對表達(dá)量最高，其次是根、葉片、花蕾中，在鱗莖中的相對表達(dá)量最低[18]；4CL基因在東方山羊豆的組織中均有表達(dá)但表達(dá)水平不同，在根中相對表達(dá)量最高，其次是莖，葉中相對表達(dá)量最低[19]。本試驗(yàn)克隆得到了一個(gè)4CL基因，該基因在果皮和果肉中的表達(dá)量最高，其次是莖和葉片，在花中的表達(dá)水平最低，其表達(dá)模式和功能可能與洋麻4CL相似。

圖中不同小寫字母表示0.05水平差異顯著；大寫字母表示0.01水平差異顯著。

肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)是木質(zhì)素合成特異途徑下游的關(guān)鍵酶，在NADPH的作用下，催化多種不同的肉桂醛(香豆醛，芥子醛，松柏醛等)及其衍生物生成木質(zhì)素單體前體物質(zhì)。CAD基因表達(dá)的研究多集中在不同組織部位、不同生育時(shí)期、不同品種等方面。其中，毛果楊的15個(gè)CAD基因中，CAD7在葉片和葉柄中相對表達(dá)量較高，CAD9在葉片中相對表達(dá)量最高，CAD12和CAD13在葉片中相對表達(dá)量最高[20]；楊樹CAD基因在葉、莖、外表皮、木質(zhì)部等組織中均表達(dá)，且表達(dá)水平不同[21]；丹參CAD基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，在根部的相對表達(dá)量最高，其次是葉，莖中最低[22]；甜瓜cmCAD5和cmCAD2在所有組織中均表達(dá)，在果實(shí)中的表達(dá)量最高，與果實(shí)的發(fā)育有密切關(guān)系，且cmCAD2與甜瓜果實(shí)木質(zhì)素合成有關(guān)，cmCAD5是花生長發(fā)育及香氣合成過程中的重要基因[23]。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，CAD在果皮和果肉中表達(dá)量最高，其次是葉和花，在莖中表達(dá)量最低，與上述植物表達(dá)模式相似，可能功能相近。

過氧化物酶(Peroxidase，POD)是1個(gè)多基因家族的氧化還原酶，參與脂質(zhì)過氧化作用、植物的呼吸作用、光合作用、生長素的降解及正常代謝和應(yīng)激反應(yīng)，包括植物體內(nèi)將3種醇單體脫氫聚合成木質(zhì)素。過氧化物酶具有多種同工酶并有種屬、組織以及發(fā)育時(shí)期特異性。Passardi等[24]研究報(bào)道，茶樹POD57是1個(gè)組成型基因，在根中相對表達(dá)量最高，在莖、葉片中依次降低，與擬南芥表達(dá)情況相似。心里美蘿卜地上和地下部分POD基因的相對表達(dá)量差異顯著，在結(jié)莢期木質(zhì)部中的相對表達(dá)量最高[25]。油菜POD基因在根中的相對表達(dá)量最高，在莖、花、葉的相對表達(dá)量依次降低[26]。目前，主要集中于研究梨POD酶學(xué)特性、分布和同工酶譜帶，對梨POD基因的克隆及定量表達(dá)分析研究很少[27-29]。本研究克隆得到了大果水晶梨褐色果皮突變體的1個(gè)POD基因，該基因在果皮和果肉中表達(dá)量高，其次為莖和葉，在花中表達(dá)量最低，與上述植物表達(dá)模式均相同。

利用RT-PCR相對定量分析方法，本試驗(yàn)首次以大果水晶梨褐色果皮突變體作為試驗(yàn)材料，系統(tǒng)地研究了PAL1、PAL2、CAD、4CL、POD基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)基因具有明顯的組織特異性。此外，這5個(gè)基因均在果皮中具有最大表達(dá)量，可能與果皮的發(fā)育具有重要關(guān)系，應(yīng)該在后續(xù)進(jìn)行褐色果皮形成機(jī)制的研究中進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。

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Tissue Specificity Express Analysis of Enzyme Genes Related to Lignin Biosynthesis in Suisho Pear Brown Pericarp Mutant

LIU Bingxu1,YU Fengming1,ZHANG Libin2,WU Junkai2,SONG Liqin2,XIAO Xiao2,DU Xiaodong3

(1.College of Life Science and Technology,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao 066004,China;2.College of Horticultural Science and Technology,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao 066004,China；3.Institute of Agricultural Information and Economy,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

In order to reveal the expression characteristic of genes (PAL1,PAL2,CAD,4CL,POD) related to lignin biosynthesis in brown pericarp mutant of Suisho pear,and provide the basis for further studying pear brown pericarp formation mechanism.RNA was extracted from different tissues according to RNA extraction kit (EASY spin,Biomed),primers were designed with Primer 5.0 and DNAMAN,expression pattern of genes were analyzed by QRT-PCR.Among the different tissues and organs,the highest relative expression ofPAL1,PAL2,CAD,4CL,PODgene appeared in peels.In peels and pulps,the relative expression ofPODgene was extremely significantly higher than the other genes.In flowers,leaves and branches phloem,the relative expression ofCADwas extremely significantly higher than the other genes.The study suggested that the expression pattern ofPAL,CAD,4CLandPODhad significant tissue-specific in the five selected tissues and organs,and these genes may be associated with the formation of Suisho pear brown peel closely.

Brown pericarp mutant of Suisho pear；Key enzymes of lignin biosynthesis；Gene；Reverse transcription-PCR(RT-PCR)；Tissue specificity expression

2016-06-07

河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.ZH2012005)

劉炳旭(1990-),女,河北邯鄲人,在讀碩士,主要從事果樹分子生物學(xué)研究。

于鳳鳴(1966-),男,河北昌黎人,教授,主要從事果樹分子生物學(xué)研究。

杜曉東(1967-)，女，河北趙縣人，副研究員，主要從事農(nóng)業(yè)信息與果樹學(xué)研究。

Q78;S661.03

A

1000-7091(2016)05-0028-07

10.7668/hbnxb.2016.05.005