冷銀芝，李應配，羅時猛，蔣建華，朱啟星，沈 彤，

◇預防醫(yī)學研究◇

雙酚A對小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

冷銀芝1，李應配1，羅時猛1，蔣建華2，朱啟星3，沈 彤1，3

目的 探討雙酚A（BPA）對小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化及細胞因子分泌的影響。方法 用不同劑量（10、100、1 000 nmol/L）BPA體外處理誘導分化過程中的小鼠3T3-L1前脂肪細胞，在第2、4、8天時，用CCK-8檢測細胞存活率，油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)含量，ELISA法測定上清液中脂聯(lián)素和瘦素的含量，實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)瘦素和脂聯(lián)素mRNA表達水平。結(jié)果 第2天時，1 000 nmol/L BPA組細胞存活率較對照組明顯升高（P＜0.05），第8天時，10、100和1 000 nmol/L BPA組細胞存活率較對照組均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；油紅O染色顯示細胞內(nèi)脂滴隨BPA劑量和時間的增加且變大；第4天時，1 000 nmol/L BPA組瘦素含量和mRNA水平均增高（P＜0.05），第8天時，100、1 000 nmol/L BPA組瘦素含量和mRNA水平均明顯增加（P ＜0.01）；第8天時，100、1 000 nmol/L BPA組脂聯(lián)素含量和mRNA水平均下降（P＜0.01）。結(jié)論 BPA促進了小鼠3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化，增加細胞瘦素分泌，抑制細胞脂聯(lián)素的分泌。

雙酚A；小鼠3T3-L1前脂肪細胞；分化；瘦素；脂聯(lián)素

近幾十年里，肥胖患病率呈全球持續(xù)升高的狀態(tài)［1］，“環(huán)境致肥胖因子”備受關注［2］。研究［3］表明環(huán)境中雙酚A（bisphenol A，BPA）是一種環(huán)境致肥胖因子。人群流行病學研究報告環(huán)境BPA暴露會增加肥胖癥、心血管疾病和糖尿病的風險［4］，動物實驗顯示BPA與脂肪細胞分化和炎癥狀態(tài)相關［5］。但是BPA引起肥胖的具體分子機制尚未完全闡明。該研究采用低劑量BPA處理體外誘導分化的小鼠3T3-L1前脂肪細胞，在不同時間點檢測細胞脂質(zhì)沉積、脂聯(lián)素和瘦素表達水平，探討低劑量BPA暴露對小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化的影響，為闡明BPA暴露導致肥胖等代謝性疾病的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 BPA（99.9%分析純，天津市大茂化學試劑廠）；BPA用DMSO助溶（終濃度不超過0.1%）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青霉素和鏈霉素（華北制藥華勝公司）；胰酶（江蘇海門市碧云天公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、地塞米松、CCK-8試劑盒、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（1-methyl-3-isobutylxanthine，IBMX）（美國Sigma公司）；胰島素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；油紅O（美國Promega公司）；酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA，蘇州卡爾文生物科技有限司）；RNA提取純化試劑盒RNeasy Mini Kit（德國QIAGEN公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司）；LightCycler 480 SYBR Green I Master、LightCycler 480 PCR儀（瑞士Roche公司）；瘦素、脂聯(lián)素和 β-actin引物（大連寶生物有限公司合成）；CO2培養(yǎng)箱（美國SHELL/JB公司）；μQuant酶標儀（美國Bio-Tek公司）；倒置顯微鏡（德國OLYMPUS公司）。

1.2 小鼠3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)、誘導分化及BPA處理 小鼠3T3-L1前脂肪細胞（美國Sigma公司）用基礎培養(yǎng)基（10%滅活胎牛血清、高糖DMEM/F12液體培養(yǎng)基，1%青鏈霉素混合液）在37℃、5%CO2下培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細胞90%融合后用于試驗。細胞用誘導分化培養(yǎng)基Ⅰ（高糖DMEM，10%滅活胎牛血清、10 mg/L牛胰島素，1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX，1%雙抗）誘導分化，同時加入10、100、1 000 nmol/L BPA處理，第2天時撤去IBMX和地塞米松，換用誘導分化培養(yǎng)基Ⅱ（高糖DMEM，10%滅活胎牛血清、10 mg/L牛胰島素、1%雙抗）繼續(xù)培養(yǎng)至第8天，每2 d換液1次。

1.3 CCK-8測定細胞增殖 將1×104個細胞接種到96孔培養(yǎng)板，在誘導分化和BPA處理后，分別在第2、4、8天時每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)1.5 ～4.0 h，用酶標儀在450 nm處測吸光度。細胞存活率（%）=［（實驗孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）］× 100%。

1.4 油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 將1×105個細胞接種于48孔板，誘導分化和BPA處理，分別在第2、4、8天時，細胞用PBS洗3次，10%甲醛固定5 min，PBS再洗3次，用0.5%油紅O染色15 min，蘇木精復染1 min，PBS沖洗至變藍，顯微鏡拍照。

1.5 ELISA法檢測細胞上清液中瘦素和脂聯(lián)素含量 誘導分化第2、4、8天時收集細胞上清液，3 187 r/min離心20 min后-20℃保存。用ELISA試劑盒檢測上清液中瘦素和脂聯(lián)素的含量，按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測細胞中瘦素和脂聯(lián)素mRNA表達 誘導分化第2、4、8天時收集細胞，用RNeasy Minin Kit試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，在LightCycler480 PCR儀上用SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒進行擴增，擴增條件：94℃預變性4 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)反應，引物序列見表1。用β-actin作內(nèi)對照，2-ΔΔCt法分析基因相對表達水平。

表1 小鼠基因的引物序列

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有實驗獨立重復至少3次，數(shù)據(jù)均以表示。多組間比較采用One-Way ANOVA，組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量BPA對誘導分化的小鼠3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響 CCK8檢測結(jié)果顯示，在同一時間點，空白對照組與DMSO組細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義；第2天時，與空白對照組比較，1 000 nmol/L BPA組細胞存活率明顯升高（F=2.54，P＜0.05）。第4天時，各組間細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義。第8天時，與空白對照組比較，100 nmol/L BPA組和1 000 nmol/L BPA組細胞存活率顯著下降（F=5.15，P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 不同劑量BPA對誘導分化的3T3-L1細胞存活率的影響（n=4）

2.2 不同劑量BPA對誘導分化的小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 誘導分化前小鼠3T3-L1前脂肪細胞貼壁，呈梭形，透亮，胞質(zhì)少且內(nèi)無脂滴。空白對照組細胞，誘導分化第2天時，細胞形態(tài)變化不明顯；第4天時細胞變圓變大，胞質(zhì)增多，油紅O染色顯示有較小脂滴；第8天時細胞變得更圓更大，胞漿更豐富，油紅O染色顯示脂滴增多變大，密集于核周，形成“指環(huán)樣”結(jié)構(gòu)。與空白對照組相比，不同劑量BPA組細胞形狀更大更圓，油紅O染色顯示細胞內(nèi)脂滴隨BPA劑量和時間的增加而增多變大，見圖2。

2.3 不同劑量BPA對誘導分化小鼠3T3-L1前脂肪細胞中瘦素和脂聯(lián)素含量的影響 第0天的瘦素基礎值是5.68 ng/ml，與誘導分化第2天的空白對照組的脂聯(lián)素水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。誘導分化到第4天時，與空白對照組比較，BPA組瘦素含量升高，1 000 nmol/L BPA組差異有統(tǒng)計學意義（F=2.09，P＜0.05）；第8天時，與空白對照組相比，BPA組瘦素含量升高更明顯，100 nmol/L和1 000 nmol/L BPA組差異均有統(tǒng)計學意義（F= 11.00，P＜0.01），見圖3。第0天的脂聯(lián)素基礎水平是1 497.84 pg/ml，與誘導分化第2天的空白對照組的脂聯(lián)素水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。第4天時，與空白對照組相比，BPA組脂聯(lián)素含量下降，但各組差異無統(tǒng)計學意義；第8天時，與空白對照組相比，BPA組脂聯(lián)素含量進一步下降，100 nmol/L 和1 000 nmol/L BPA組差異均有統(tǒng)計學意義（F= 10.53，P＜0.01，P＜0.01），見圖4。

圖2 油紅O染色觀察BPA對小鼠3T3-L1前脂肪細胞誘導分化的影響 ×200

圖3 不同劑量BPA對誘導分化小鼠3T3-L1前脂肪細胞中瘦素含量的影響（n=3）

2.4 不同劑量BPA對誘導分化小鼠3T3-L1前脂肪細胞中瘦素和脂聯(lián)素mRNA水平的影響 誘導分化2天，與空白對照組相比，各BPA組細胞中瘦素mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義；第4天時，與空白對照組比較，BPA組瘦素mRNA水平上調(diào)，1 000 nmol/L BPA組差異有統(tǒng)計學意義（F=4.03，P＜0.05）；第8天時，與空白對照組相比，BPA組瘦素mRNA水平進一步上調(diào)，100 nmol/L BPA組和1 000 nmol/L BPA組差異均有統(tǒng)計學意義（F=11.24，P＜0.01），見圖5。誘導分化第2天，與空白對照組相比，各BPA組細胞中脂聯(lián)素mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義；第4天時，與空白對照組比較，BPA組脂聯(lián)素mRNA水平下調(diào)，1 000 nmol/L BPA組差異有統(tǒng)計學意義（F=0.71，P＜0.05）；第8天時，與空白對照組相比，BPA組脂聯(lián)素mRNA水平進一步下調(diào)，10、100、1 000 nmol/L BPA組差異均有統(tǒng)計學意義（F=54.40，P＜0.01），見圖6。

圖4 BPA對誘導分化小鼠3T3-L1前脂肪細胞中脂聯(lián)素含量的影響（n=3）

圖5BPA對誘導分化小鼠3T3-L1前脂肪細胞瘦素mRNA水平的影響（n=3）

圖6 BPA對誘導分化小鼠3T3-L1前脂肪細胞脂聯(lián)素mRNA水平的影響（n=3）

3 討論

日常生活中人類廣泛接觸的BPA可以通過多種暴露途徑進入人體，其在體內(nèi)以結(jié)合或單體的形式存在，尿液濃度范圍為0.4～44 nmol/L［6］。近年來對體內(nèi)生理相關劑量BPA（≤1×10-7mol/L）的暴露與肥胖關系研究已成為人們關注的熱點［7］。

肥胖是體內(nèi)脂肪過度合成、體重增加為重要特征的一種代謝異常，主要為前脂肪細胞數(shù)量異常增加和分化。前脂肪細胞分化過程首先是前脂肪細胞融合后的克隆性增殖，接著是增殖終止并開始分化，最終分化為成熟的脂肪細胞［4］。體外研究［8］顯示人前脂肪細胞在暴露50 μmol/L BPA 48 h后開始向脂肪細胞分化，小鼠3T3-L1前脂肪細胞在誘導分化條件下100 nmol/L BPA組的脂肪細胞的分化程度更大，且分化程度與BPA暴露濃度和時間呈正相關性［5］。本研究結(jié)果顯示，誘導分化第2天時1 000 nmol/L BPA組顯著增加細胞存活率，表明誘導分化早期較高劑量BPA促進細胞增殖；第4天時各組細胞存活率差異不明顯，表明誘導中期BPA誘導的細胞增殖減少，而細胞開始分化；第8天時100和1 000 nmol/L BPA組細胞存活率明顯抑制，表明誘導晚期BPA促進細胞向脂肪細胞分化。油紅O染色檢測也顯示BPA能促進細胞內(nèi)脂滴的沉積增多，也表明BPA促進前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化。以上結(jié)果表明BPA促進小鼠前脂肪細胞向脂肪細胞分化。

肥胖的病理基礎是全身慢性低度炎癥狀態(tài)，主要表現(xiàn)為脂肪組織中促炎因子維持較高水平和抗炎因子被抑制，其中炎性因子如瘦素，抗炎因子如脂聯(lián)素都是由脂肪細胞分泌的重要的脂肪因子。人群資料顯示孕期暴露高水平BPA可致子代體內(nèi)瘦素水平升高［9］。體外研究［10］表明微摩爾級濃度BPA引起前脂肪細胞瘦素等脂肪因子分泌增加趨勢呈現(xiàn)時間劑量依賴關系。研究［11］證實肥胖個體內(nèi)脂聯(lián)素水平比瘦體低，不同種族的肥胖、2型糖尿病等與低血漿脂聯(lián)素水平相關；體外研究［12］環(huán)境相當劑量BPA能夠抑制人體脂肪組織及脂肪細胞的脂聯(lián)素合成。本研究結(jié)果顯示，瘦素含量和mRNA水平隨BPA劑量的遞增和誘導時間的延長而增加；脂聯(lián)素含量和mRNA水平則隨BPA劑量的遞增和誘導時間的增長而下降，表明低劑量BPA促進誘導分化小鼠前脂肪細胞中瘦素分泌，抑制其中脂聯(lián)素的分泌。以上表明環(huán)境BPA暴露誘導肥胖可能與其干擾脂肪因子瘦素和脂聯(lián)素的分泌有關。

本研究表明低劑量BPA可促進誘導分化的小鼠3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，并通過增加瘦素分泌和抑制脂聯(lián)素的分泌發(fā)揮作用。這為闡明BPA促進肥胖及相關的代謝綜合征發(fā)病機制提供了實驗資料，但BPA促進脂肪細胞分化的分子機制還需深入研究。

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Effects of bisphenol A on differentiation of mice 3T3-L1 preadipocytes

Leng Yinzhi，Li Yingpei，Luo Shimeng，et al
（Dept of Health Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei230032）

Objective To explore the effect of bisphenol A（BPA）on the differentiation of mice 3T3-L1 preadipocytes in vitro.Methods Mice 3T3-L1 preadipocytes were stimulated for differentiation of mature adipocytes in vitro.Meanwhile cells were treated with 10，100 and 1 000 nmol/L BPA，blank control groups and vehicle control groups were established at the same time.On 2nd，4th and 8th day，the cell viability was measured by CCK8 assay. On 4th and 8th day，the lipid content of mice 3T3-L1 preadipocytes was determined by oil red O staining.On 2nd，4th and 8th day，the levels of leptin and adiponectin were analyzed by ELISA assay，the leptin and adiponectin mRNA in mice 3T3-L1 preadipocytes were measured by RT-PCR.Results On 2nd day，compared with the blank control，the cell viability was significantly increased in 1 000 nmol/L BPA groups（P＜0.05）；on 8th day，the cell viability was significantly inhibited in 10，100 and 1 000 nmol/L BPA groups（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）.Red oil O staining showed that lipid droplets in intracellular was increased and became increasingly larger in dose and time dependent manner.On 4th day，leptin factor and leptin mRNA levels in 1 000 nmol/L BPA groups were elevated （P＜0.05）；on 8th day，leptin factor and leptin mRNA levels were all significantly elevated（P＜0.01，P＜0.01）in 100 and 1 000 nmol/L BPA groups.On 8th day，adiponectin factor and adiponectin mRNA were all suppressed （P＜0.01，P＜0.01）in 100 and 1 000 nmol/L BPA groups.Conclusion BPA accelerates differentiation of mice 3T3-L1 preadipocytes and interferes with the secretion of adipokines.

bisphenol A；mice 3T3-L1 preadipocytes；differentiation；leptin；adiponectin

R 114

A

1000-1492（2016）09-1281-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.022.html

2016-05-04接收

國家自然科學基金（編號：81473015）

安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院1衛(wèi)生毒理學系、3職業(yè)衛(wèi)生 與環(huán)境衛(wèi)生學系，合肥 2300322安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，合肥 230022

冷銀芝，女，碩士研究生；沈 彤，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ahmusht@163.com