孫 晶，宋東輝，劉鳳路，邸富榮

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋與環(huán)境學院 天津 300457）

一株烷烴降解細菌的分離鑒定及其降解特性

孫 晶，宋東輝，劉鳳路，邸富榮

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋與環(huán)境學院 天津 300457）

從天津海域采集的水樣中篩選獲得一株烷烴降解細菌，經16S rRNA基因鑒定，結合菌株的形態(tài)學特征和生理生化特性分析，鑒定為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），命名為Citrobacter sp.TUST-S5.利用GC-MS檢測出菌株Citrobacter sp.TUST-S5能降解鏈長C11—C28的烷烴；對C20以上的長鏈烷烴，降解率為80%以上，且降解率隨碳鏈長度的增加呈升高的趨勢；菌株的生長曲線及降解曲線顯示菌株對烷烴的降解率的變化與菌濃度緊密相關；菌株的乳化活性為47.86%疏水性為38.30%.菌株Citrobacter sp.TUST-S5對中長鏈烷烴的降解效果顯著，乳化作用明顯，對于修復海洋石油污染具有重要的作用.

烷烴降解細菌；檸檬酸桿菌屬；降解率；乳化活性；疏水性

海上發(fā)生的漏油事件對海洋環(huán)境具有很大的危害［1］，嚴重地破壞了周圍的生態(tài)系統(tǒng)［2］.目前，海洋石油污染的處理方法主要有物理法、化學法和生物法.與物理法和化學法相比，生物法具有經濟花費少、對環(huán)境影響小、遺留問題少、修復時間短、就地修復、操作方便等優(yōu)勢［3-4］.

石油烴降解菌（hydrocarbon degradation bacteria，HDB）是能將石油烴作為唯一碳源進行生物降解，并產生氣體、脂肪酸及生物表面活性劑等代謝產物的一類微生物［5］，在生物修復中起到至關重要的作用，而烷烴降解細菌又是石油烴降解細菌中不可或缺的一類.目前，已有多種烷烴降解細菌被分離出來，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、不動桿菌屬（Aeinetobacter）、黃桿菌屬（Flavobaeterium）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、產堿桿菌屬（Alcazigenes）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、棒桿菌屬（Coryhebacterium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、微球菌屬（Microeoceus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、食烷菌屬（Alcanivorax）等屬［6-7］由碳氫化合形成的烴類構成石油的主要成分，約占95%～99%［8］.在海洋環(huán)境中，由于風化等作用，石油烴中的輕組分大量減少，而重組分因難以揮發(fā)及生物降解緩慢而長期留在環(huán)境中造成污染［9］.目前，針對海洋石油污染狀況，采用最多的是分離海洋微生物來進行海洋石油污染的生物修復研究［10］，因為該類微生物能更好地適應海洋環(huán)境.因此，篩選到能夠快速、有效地降解石油烴的微生物對修復石油污染的海洋環(huán)境具有重要的意義.

本文從天津石油污染海域分離出能夠有效降解石油中烷烴組分的烷烴降解細菌，對其進行生理生化分析及分子生物學鑒定，并對菌株的烷烴降解能力及其他促進降解的因素進行探究，旨在了解菌株在烷烴降解方面的優(yōu)勢，為海洋石油污染治理工作提供支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

實驗樣品采自天津港南疆港區(qū)原油裝卸碼頭海域（38°41′N，117°22′E）表層海水.

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基為Bushnell Haas Mineral Salts（BHMS）培養(yǎng)基［11］（g/L）：KH2PO41，K2HPO40.2，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.02，NH4NO31，60% FeCl3溶液2滴，加海水（鹽度29）至1，L，pH 7.0.加入體積分數為1%的0.22，μm濾膜過濾的0#柴油（市售），1×105，Pa高壓蒸汽滅菌20，min.

細菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［12］（g/L）：牛肉膏5，蛋白胨5，NaCl 3，加入蒸餾水至1，L，攪拌均勻使其溶解，pH 7.0～7.2，1×105，Pa高壓蒸汽滅菌20，min.

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

在100，mL篩選培養(yǎng)基中加入5，mL采集樣品，28，℃、150，r/min振蕩培養(yǎng)2周，取1%接種至新鮮的篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周，重復3次.菌液經1∶10、1∶100、1∶1，000、1∶10，000稀釋后在固體BHMS培養(yǎng)基涂布，28，℃培養(yǎng)至長出菌落，選取不同形態(tài)特征的單菌落，劃線培養(yǎng)純化出單菌落.

1.2.2 菌株的鑒定

菌株的分子生物學分析：在100，mL細菌培養(yǎng)基中接種1，mL活化菌株，28，℃、150，r/min振蕩培養(yǎng)，在菌液A600為1.0～1.5時，提取基因組DNA，進行16S rRNA基因擴增.正向引物為27，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTTGGCTCAG-3′，反向引物為1，492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，反應體系及反應條件參考文獻［13］：25，μL的PCR擴增體系如下：引物27F 1，μL；引物1，492R 1，μL；dNTP Mixture 0.25，μL（20，mmol/L）；10×PCR buffer 2.5，μL；taq酶0.5，μL（5，U/μL）；DNA樣本1，μL；無菌水18.75，μL.擴增條件：95，℃預變性5，min；94，℃變性30，s，53，℃退火1，min，72，℃延伸1，min，30個循環(huán)；72，℃延伸10，min；PCR產物于4，℃保存，待測.將PCR產物進行雙向測序.在Eztaxon （http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon）中進行核酸序列的比對，并在MEGA5.2軟件中用Neighbour-Joining法進行建樹分析［14］，Bootstrap選擇1，000次.

菌株及菌落的形態(tài)學分析：觀察單菌落的顏色、大小、形狀、邊緣、凸起、透明度及光澤等特征.從單菌落中挑取菌株固定于玻片后，經不同濃度的乙醇梯度脫水［15］，在掃描式電子顯微鏡下觀察菌株的形態(tài).

菌株的生理生化分析：對菌株進行革蘭氏染色、甲基紅、V.P.、接觸酶、酯酶、蛋白酶、脲酶、纖維素酶、硝酸鹽還原、葡萄糖氧化發(fā)酵等一系列生理生化分析［16-17］.

1.2.3 菌株的降解特性

樣品萃?。涸?00，mL BHMS培養(yǎng)基中，加入體積分數為1%的0.22，μm濾膜過濾的0#柴油，1×105，Pa滅菌20，min后，加入1%菌懸液，以此作為實驗組；設置未加菌懸液的培養(yǎng)基為對照組.28，℃、150，r/min振蕩培養(yǎng)10，d，用正己烷萃取降解后培養(yǎng)基中的殘油組分，除水，再用0.22，μm濾膜過濾，4，℃保存.

GC-MS對采集的樣品進行分析時，選擇的標準品為C7—C30正構烷烴及異三十烷，標準品的配制及程序升溫條件參考文獻［18］：取C7—C30的正構烷烴標準品溶解于正己烷溶液中，稀釋到終質量濃度為100，mg/L，將異三十烷作為內標物（IS），用正己烷溶液溶解，稀釋成質量濃度為100，mg/L，將內標物與標準品等體積混合，并在每個樣本中都加入相同體積的內標物，混合均勻后，待測.測得各組分質量濃度后，按照式（1）—式（3）計算降解率.

式中：ρ前為降解前培養(yǎng)基中正構烷烴的質量濃度（mg/L），ρ實、ρ對分別為降解后的實驗組和對照組中正構烷烴的質量濃度（mg/L），D1為培養(yǎng)基中殘油的總降解率（%），D2為自然風化等作用引起的降解率（%），D3為菌株對柴油的降解率（%）.

1.2.4 菌株的生長與降解

在100，mL BHMS培養(yǎng)基中，加入體積分數為1%的十六烷后，接種1，mL菌懸液，28，℃、150，r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24，h測定A600，繪制菌株的生長曲線.同時，利用氣相色譜法，測定菌株降解率，繪制降解曲線.

1.2.5 乳化活性與疏水性

相同體積的菌懸液和正十六烷渦旋混合，靜置24，h后分層.按照式（4）計算乳化活性（%）［19］.

式中：h1和h2分別為乳化層高度（mm）和總的液柱高度（mm）.

相同體積的菌懸液和正十六烷渦旋混合，靜置24，h后分層.取下相，以磷酸緩沖液（pH 7.0）為空白對照，測定600，nm下的吸光度，按照式（5）計算疏水性（%）［20］.

式中：A對照和A實驗分別為對照組和實驗組吸光度.

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

從樣本中共分離出6株能降解烷烴的菌株，其中1株菌株不僅在菌落形態(tài)、顏色等方面與其他菌株不同，而且環(huán)境適應能力相對較強，降解率也相對較高，標記為TUST-S5，并對其進行進一步的研究.

2.2 菌株的鑒定

菌株TUST-S5在BHMS培養(yǎng)基上形成單菌落，如圖1（a）所示，菌落呈乳白色，圓形，直徑達1.5，mm，中間隆起，邊緣光滑，不透明.菌株TUSTS5電鏡掃描的結果如圖1（b）所示，菌株為桿狀菌，長短不一，其長度大約為1～2，μm.

圖1 菌株TUST-S5的菌落形態(tài)圖和掃描電鏡圖Fig. 1Colony morphology and electron microscope scan ning map of strain TUST-S5

菌株TUST-S5的部分生理生化特征如下：革蘭氏陰性菌，不具有運動性，甲基紅實驗、硝酸鹽還原實驗均成陽性；能產生過氧化氫酶、脂肪酶、蛋白酶及脲酶；V.P.反應呈陰性；不產生淀粉酶、纖維素酶；葡萄糖氧化發(fā)酵類型為發(fā)酵型.

16 S rRNA基因擴增產物測序后得到序列長度為1，432，bp，在Eztaxon（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）比對，發(fā)現(xiàn)該菌與間甲酚降解菌（Citrobacter farmeri）中的模式株Citrobacter farmeri CDC 2991-81（T）的相似性達98.46%.菌株TUST-S5的系統(tǒng)進化樹如圖2所示，菌株TUST-S5與檸檬酸桿菌屬中Citrobacter sp. T7（2011）的親緣關系最近，結合菌株的形態(tài)學特征及生理生化特征，將菌株歸類為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.），命名為Citrobacter sp. TUST-S5，GeneBank登錄號為KM186147.

圖2 菌株TUST-S5的16S rRNA系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of TUST-S5 16S rRNA

2.3 菌株的降解特性

降解前培養(yǎng)基中的油組分分布圖，如圖3（a）所示；培養(yǎng)10，d后，對照組和實驗組培養(yǎng)基中的殘油組分分布圖，如圖3（b）和圖3（c）所示.殘油組分的濃度根據出峰時間和峰面積得出，根據降解率計算式（1）—式（3），分別計算出不同組分的總降解率、自然降解率及菌株的降解率，結果見表1.

圖3 培養(yǎng)基中烷烴峰圖Fig. 3 Peak diagram of residual oil component in culture medium

表1 培養(yǎng)基中烷烴質量濃度及菌株的降解率Tab. 1 Concentration of residual oil in culture medium and the degradation rate of the strain

菌株TUST-S5能降解鏈長C11—C28的烷烴，降解率集中在60%～95%，對于鏈長在C20以上的烷烴，菌株的降解率達到了80%以上，且降解率隨著碳鏈長度的增加呈升高的趨勢，如圖4所示.菌株對短鏈烷烴的降解率相對較低，但也達到了60%.

2.4 菌株以正十六烷為唯一碳源的生長與降解

菌株的生長曲線及降解曲線如圖5所示.

圖4 菌株的降解率隨烷烴鏈長的變化圖Fig. 4 Change of degradation rate with alkane chain length

圖5 菌株Citrobacter sp．TUST-S5的生長曲線與降解曲線Fig. 5Growth curve and degradation curve of Citrobacter sp．TUST-S5

正十六烷的降解與菌濃度緊密相關，菌株在培養(yǎng)的第1～2 天，生長十分緩慢，處于延滯期，大約有10%的正十六烷被降解；從第2 天菌株開始進入對數期，整個對數期持續(xù)2，d左右，對正十六烷的降解率由10%上升到60%；在第4～5天菌株進入了穩(wěn)定期；之后菌濃度出現(xiàn)了下降的趨勢，進入了衰退期，此時，正十六烷的降解率上升到72%左右.

2.5 菌株的乳化活性與疏水性

在菌株培養(yǎng)過程中產生明顯的乳化現(xiàn)象，實驗測得菌株的乳化活性為47.86%，疏水性為38.30%.

3 討 論

檸檬酸桿菌屬的菌株多為腸道菌［21］.從天津石油污染海域分離出1株烷烴降解細菌，鑒定為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），命名為Citrobacter sp.TUSTS5（GeneBank登錄號為KM186147）.Citrobacter sp.TUST-S5在培養(yǎng)過程中對環(huán)境的適應能力較強，且能有效地降解石油烴中的烷烴組分，尤其對中長鏈烷烴的降解率達80%以上，降解效果明顯.菌株對短鏈烷烴的降解效果相對較低，推測原因為短鏈烷烴對菌株本身具有一定的毒性［22］.

目前，已有相當多的烷烴降解細菌被分離出來，其中也不乏一些降解能力較好的菌株，但在對烷烴的降解范圍上又存在瑕疵，例如芽胞桿菌（Geobacillus）strain DM-2［23］能降解C16—C36的烷烴，其中對C28的降解量最高，達 88.95%對鏈長小于C15的烷烴降解作用極小，其中對 C14的降解率僅為 2%；嗜熱脂肪芽胞桿菌（Bacillus stearothermophilus）對C15—C17的烷烴降解率高達88.5%，但是對鏈長小于C15及大于C17烷烴只有極小的降解作用［24］；嗜熱芽胞桿菌（Thermophilic bacillus）NG80-2只能降解C15—C36的烷烴，對C8—C14的烷烴及鏈長大于C40的烷烴沒有任何降解作用［25］.石油污染物成分復雜［26］，其中烷烴組分占有很大一部分，僅能夠降解長鏈烷烴或短鏈烷烴的菌株都不能很好地降解石油污染物，而菌株Citrobacter sp.TUST-S5在這方面存在明顯的優(yōu)勢.如果將該菌株與其他降解短鏈烷烴的優(yōu)勢菌株建立混合菌群［27］，混合菌群之間具有協(xié)同降解作用，其降解效果明顯高于單株培養(yǎng)菌［28］，更有利于海洋環(huán)境的治理.

生物表面活性劑是微生物在特定條件下生長過程中分泌并排出體外的具有表面活性的代謝產物［29］，烷烴降解菌株的乳化活性對菌株的降解能力起到一定的促進作用［30］.Suzuki等［31］發(fā)現(xiàn)菌體表面的疏水性也能夠促進細菌對石油的降解率.菌株TUST-S5與某些同功能的菌株如Rhodococcus erythropolis G2［32］（乳化活性為30.8%疏水性為27%）及Achromobacter piechaudii strain O1［31］（乳化活性為35.7%疏水性為32%）比較，該菌株的乳化活性及疏水性均相對較高.菌株TUST-S5作用于正十六烷時，菌株通過較高的疏水性與正十六烷接觸，乳化作用進一步促進正十六烷的降解.進一步了解乳化作用及疏水作用促進降解的機理將更加有利于提高菌株對烷烴的降解率.

關于烷烴降解菌株對烷烴降解途徑的研究已有相關的報道［33］.今后將對Citrobacter sp.TUST-S5的降解途徑及降解機理進行探究，這對于進一步提高菌株的降解能力具有重要的實際意義.

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責任編輯：郎婧

Isolation and Identification of an Alkane Degrading Bacterium and its Degradation Characteristics

SUN Jing，SONG Donghui，LIU Fenglu，DI Furong
（Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，College of Marine and Environmental Sciences，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

An alkane degrading bacterium was isolated from the water samples collected from Tianjin sea area.The strain was defined as Citrobacter sp.TUST-S5 according to its physiological and biochemical characteristics as well as 16S rRNA phylogenetic tree.Its degradation rate was determined by GC-MS.Results showed that Citrobacter sp.TUST-S5 had the capacity of degradating C11-C28 alkane and its degradation rate of long chain alkane over C20 was more than 80%.The growth curve and degradation curve of the strain displayed a change of the degradation rate closely related to the concentration of bacteria.Its emulsifying activity and the hydrophobicity were 47.86% and 38.30%.Therefore，Citrobacter sp.TUST-S5 has a good ability to degrade C11-C28 alkane，and will play an important role in remedying marine oil pollution.

alkane degrading bacteria；Citrobacter；degradation rate；emulsifying activity；hydrophobicity

Q939.9

A

1672-6510（2016）05-0019-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150146

2015-10-09；

2015-12-10

天津市海洋局科技興海項目（KJXH2013-16）

孫 晶（1990—），女，山東禹城人，碩士研究生；通信作者：宋東輝，教授，dhsong@tust.edu.cn.