曾建敏，陳學軍，吳興富，焦芳嬋，肖炳光，李永平，童治軍

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術育種重點實驗室，國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021

基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記的煙屬植物遺傳多樣性分析

曾建敏，陳學軍，吳興富，焦芳嬋，肖炳光，李永平，童治軍

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術育種重點實驗室，國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021

利用本實驗室前期開發(fā)的煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記，對屬于3個煙草亞屬、9個組共35份野生煙草種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析。利用20對SSR引物在35份野生煙草材料中共擴增獲得176個多態(tài)性條帶，每對SSR引物可檢測的多態(tài)性條帶數(shù)為2～19個，平均為8.8個。35份材料間遺傳相似性系數(shù)（GS）在0.20～1.00之間，平均為0.57，表明煙屬種間的遺傳多樣性豐富，遺傳差異較大，親緣關系較遠。雖然3個亞屬間的界限不明顯，但在適當?shù)倪z傳相似性系數(shù)條件下，除香甜煙草組外，35份野生煙草按其組可清晰地聚為7類，表明2種細胞器基因組SSR標記適合用于煙草種間進化、分類、遺傳分析等方面研究。

野生煙草；遺傳多樣性分析；簡單序列重復標記

煙草在植物分類學上屬于茄科（Solanaceae）、煙草屬（Nicotiana），其起源于美洲、大洋洲、南太平洋上一些島嶼及近代非洲[1-2]。根據(jù)其原產(chǎn)地、植物學形態(tài)特征、染色體數(shù)目、染色體形態(tài)結構、染色體聯(lián)會特點、種間雜交的可能性、種間雜種育性等，美國學者Goodspeed將煙草屬分為黃花煙亞屬（Rustica）、普通煙亞屬（Tabacum）和碧冬煙亞屬（Petunioides）3個亞屬、14個組、60個種[3]。隨后，人們對Goodspeed的工作進行了大量深入研究并做了修正與擴充，1994年，日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社對煙草屬66個種進行了系統(tǒng)的分類[4]，2004年，Knapp認為煙草屬有76個種[5]。而種植的煙草只有2個種，即普通煙草和黃花煙草，因育種工作者過度依賴少數(shù)骨干親本，造成普通煙草（尤其是烤煙）栽培品種間的遺傳背景越來越趨同、遺傳基礎愈來愈狹窄、可利用的種質(zhì)資源也越來越匱乏[6-7]。

早期，因基因組信息匱乏，在分子水平上對煙草遺傳育種的研究進展緩慢，主要局限于隨機引物擴增長度多態(tài)性（Random Ampli fi ed Polymorphic DNA，RAPD）[8-10]、擴增片段長度多態(tài)性（Ampli fi ed Fragment Length Polymorphic，AFLP）[11-13]、 序 列相關擴增多態(tài)性標記（Sequence Related Ampli fi ed Polymorphism，SRAP）[6]和區(qū)間簡單序列重復（Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR）[6,14]等非特異性的分子標記。這些非特異性的分子存在標記穩(wěn)定性差、多態(tài)性低、操作復雜、重復性差、標記顯性，且應用成本較高等缺點。SSR標記克服以上缺點，但因缺乏足夠的煙草基因組信息，直到2007年，首張SSR標記的煙草遺傳連鎖圖譜才公布，使得基于SSR標記的煙草種質(zhì)資源親緣關系（遺傳多樣性）的研究方興未艾，但這些研究均集中在煙草的栽培品種上[15-19]。作為細胞器的葉綠體和線粒體基因組在植物種屬間具有很高的保守性，因此，細胞器基因組SSR不僅具有核基因組SSR標記的共顯性、重復性好等固有特點，而且還具有很好的種屬通用性[20]，繼而被廣泛應用于物種的起源、進化、分類及種質(zhì)資源多樣性分析等研究領域[21-23]。迄今，基于煙草細胞器基因組SSR標記對野生煙草種質(zhì)資源的研究在國內(nèi)外尚未見報道。因此，利用煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記對野生煙草種質(zhì)資源進行遺傳分析，在促進煙草屬內(nèi)各近緣種遺傳研究的發(fā)展、挖掘和利用煙草野生種的優(yōu)良基因、拓寬煙草栽培種質(zhì)的遺傳基礎等方面就顯得十分迫切和重要。

本研究利用本實驗室前期公布的煙草細胞器基因組SSR標記[24]，對屬于3個煙草亞屬、9個組的35份野生煙草種質(zhì)資源的親緣關系進行研究，旨在為從分子水平上對野生煙草種質(zhì)資源的研究、利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的35份野生煙草種質(zhì)資源由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院、中國煙草育種研究（南方）中心提供，其中，黃花煙亞屬1個組包含了4份材料（W01～W04）；普通煙亞屬1個組包含了6份材料（W05～W10）；其他25份材料（W11～W35）屬于碧冬煙亞屬的7個組。35份野生煙草材料的詳細信息見表1。

表1 35份供試材料在煙草屬的分類信息Tab.1 Classi fi cation information of 35 materials in genus Nicotiana

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組DNA提取

35份供試野生煙草材料基因組DNA的提取、純化和稀釋，參照梁景霞等[25]的CTAB大量法略作修改。其中將65℃水浴時間延長至60 min，將離心轉(zhuǎn)速提高至12000 rpm，以提高煙草基因組DNA的得率和純度。

1.2.2 煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物

在本實驗室前期公布的煙草細胞器基因組SSR引物中[24]，選取能夠擴增出條帶清晰、重復性好且在野生煙草中具有較好多態(tài)性的SSR引物各10對，引物的詳細信息見表2。

表2 煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物序列信息Tab. 2 Information of SSR primer pairs in chloroplast genome and mitochondria genome of Nicotiana

1.2.3 PCR擴增分析

煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物的PCR擴增及擴增產(chǎn)物的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，參照李緒英等[24]的方法進行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

參照李巖等[26]的方法，對PCR擴增產(chǎn)物的檢測結果進行統(tǒng)計、整理。根據(jù)Nei等[27]提供的公式計算35份野生煙草材料間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient , GS），利用NTSYSpc Version 2.11軟件[28]進行聚類分析，并構建分子進化系統(tǒng)樹。

2 結果與分析

2.1 煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記的多態(tài)性分析

煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物均能穩(wěn)定的擴增出清晰、大小與預期片段相符的條帶（圖1）。20對SSR引物在35份野生煙草材料中共擴增獲得176個多態(tài)性條帶，每對SSR引物可檢測的多態(tài)性條帶數(shù)為2～19個，平均為8.8個。其中，10對基于煙草葉綠體基因組開發(fā)的SSR引物在35份野生煙草材料中共擴增得到59個多態(tài)性條帶，每對SSR引物可檢測的多態(tài)性條帶數(shù)為2～13個，平均為5.9個。10對煙草線粒體基因組SSR在供試的35份野生煙草中共擴增出117個多態(tài)性條帶，每對引物可檢測3～19個多態(tài)性條帶，平均為11.7個?？梢?，基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組序列開發(fā)的SSR標記在檢測野生煙草基因組遺傳多態(tài)性上有很高的檢出效率。

圖1 引物Tcp067在35份野生煙草中的電泳結果Fig. 1 PCR products of SSR primer Tcp067 on non-denaturing PAGE by silver staining in 35 wild Nicotiana species

2.2 35份野生煙草種質(zhì)的遺傳相似性分析

遺傳相似性分析結果表明，參試的35份煙草野生資源的遺傳多樣性豐富，相似性系數(shù)在0.20～1.00之間，變化范圍較大，平均為0.57（表3）。其中，N.suaveolens（W33）與其他 34份煙草材料間的遺傳相似性系數(shù)最高，平均為0.86；而N.africana（W25）與其余34份煙草材料間的遺傳相似性系數(shù)最低，平均為0.23。同屬于香甜煙草組（Suaveolentes）的N.gossei（W31）和N.suaveolens（W33）間的遺傳相似性系數(shù)最大，達到1.00；同屬于圓錐煙草組（Paniculata）的N.paniculata（W02）和N.benavidesii（W04），及同屬于香甜煙草組（Suaveolentes）的N.occidentalis（W34）與N.gossei（W31） 和N.suaveolens（W33） 間 的 遺 傳相似性系數(shù)均高達0.98；而N.africana（W25）分別與N.paniculata（W02）、N.benavidesii（W04）、N.tomentosa（W05）、N.tomentosiformis（W06）、N.otophora（W07）和N.kawakamii（W08）間的遺傳相似性系數(shù)最低，為0.20。

表3 35份野生煙草材料間的遺傳相似性系數(shù)Tab. 3 Genetic similarity coefficient in 35 wild tobacco materials

2.3 35份野生煙草種質(zhì)的聚類分析

從UPGMA法聚類結果（圖2）看出，供試的35份野生煙草資源并未完全按照經(jīng)典的三個亞屬（黃花煙亞屬（Rustica）、普通煙亞屬（Tabaccum）和 碧冬煙亞屬（Petunioides）進行分類，即在分子水平上，無法將參試的35份野生煙草材料清晰的劃分為各自所屬的亞屬，但各個不同的組（section）卻能較好的區(qū)分開。在相似性系數(shù)為0.50處，可將新發(fā)現(xiàn)于非洲的野生煙N.africana（W25）與剩余的34份材料劃分開，而剩余的34份材料在適當?shù)倪z傳相似性系數(shù)處，則能很清晰的聚為10個組，但3個亞屬間的界限卻不明顯。在聚類所獲得的10個煙草組中，除香甜煙草組（Suaveolentes）外，其余7個組與傳統(tǒng)的分組相吻合。

圖2 35份野生煙草材料的聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram derived from UPGMA cluster analysis of 35 wild tobacco materials

3 討論

3.1 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記的野生煙草資源研究

在分子水平上對煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究報道較多，但絕大部分的研究集中在RAPD、AFLP、SRAP和ISSR等非特異性標記對屬于普通煙亞屬栽培種間的親緣關系分析[6,8-14]。利用特異性的SSR標記對煙草種質(zhì)的研究報道始于2007年，之后應用廣泛，如烤煙[17]、栽培煙草[18]親緣關系分析，赤星病抗、感煙草資源區(qū)分[22]，但核基因組SSR標記在煙草種間的可用率極低[16]。

迄今為止，尚未有利用煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記對野生煙草種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析的研究。本研究利用10個煙草葉綠體基因組SSR標記和10個煙草線粒體基因組SSR標記，在35份野生煙草種質(zhì)資源（35個野生煙草種）中分別擴增出59和117個多態(tài)性條帶，每個SSR標記可檢測的多態(tài)性條帶數(shù)分別為2～13和3～19個，平均為5.9和11.7個，且20個SSR標記在35個野生煙草種間均能進行有效的PCR擴增。兩種細胞器基因組SSR標記在35個野生煙草種間的多態(tài)率（多態(tài)性SSR標記數(shù)目/總SSR標記數(shù)目×100）及每個多態(tài)性SSR標記可檢測的多態(tài)性條帶數(shù)差異較大，煙草線粒體基因組SSR標記具有更高的效率，多態(tài)率約為葉綠體基因組SSR標記的兩倍。雖然葉綠體和線粒體內(nèi)各自含有一套不同于細胞核且具有相對獨立的遺傳物質(zhì)，但綠色植物協(xié)同進化過程中，葉綠體能夠使維持自身基本功能的許多遺傳物質(zhì)以母性遺傳的方式較好保留下來，比線粒體種屬間的保守性更強。由此可見，葉綠體基因組和線粒體基因組在生物的種屬間均具有很強的保守性，其在煙屬種間具有豐富的遺傳多樣性，這兩種細胞器基因組SSR標記也比細胞核基因組SSR標記具有更強的種屬通用性，基于煙草細胞器基因組SSR標記在種間或更高分類級別上對煙草遺傳育種領域的研究是可行的。

3.2 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記的野生煙草種聚類分析

在分子水平上，對煙草屬內(nèi)66個種的起源、進化及親緣關系的研究報道已有很多。如Aoki等[29]利用煙草葉綠體matK基因序列證實了煙草祖先種染色體基數(shù)為n=12，且起源于南美洲。Chase等[30]利用核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）并結合基因組原位雜交（GISH）方法，對煙草屬內(nèi)66個種進行系統(tǒng)發(fā)育及屬內(nèi)雜交種起源研究。Clarkson等[31]利用煙草內(nèi)含子trnL、間隔子trnL-F和trnS-G、基因ndlF和matK等質(zhì)體DNA序列的聚類結果表明，N.tabacum起源于南美洲的南部。隨后，Clarkson等[32]研究表明，利用低拷貝的核基因序列尋找多倍體的祖先種非常有用。對野生煙草種的聚類分析大多采用 AFLP標記[33]、核基因組SSR標記[16]等。本研究利用煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記[20]，對35份野生煙草材料進行分類，但結果與以形態(tài)特征和生化表型為基礎的系統(tǒng)分類存在一定的出入，同一亞屬的野生煙草種并未聚在一類，而同一組（除香甜煙草組）的野生煙草材料卻能在適當?shù)倪z傳相似性系數(shù)下清晰的劃分在一起。香甜煙草組（Suaveolentes）中的12份材料（W24～W35，見表1）則被劃分成3個部分， 即N.velutina（W26） 和N.rotundifolia（W30）為一組，N.fragrans（W27）和N.debneyi（W32）為一組，剩余的8份材料為一組。此外，本屬于該組的N.africana（W25）則被單獨歸為一類，而屬于裸莖煙草組（Nudicaules）的N.benthamiana（W23）則被歸為香甜煙草組（Suaveolentes）。該結果與Moon等[16]基于煙草核基因組SSR標記的研究結果一致，而與李鳳霞等[33]基于AFLP標記的研究結果截然不同。究其原因：1）可能是煙草屬3個亞屬下的分組在現(xiàn)有的研究中差別較大，以形態(tài)特征為基礎的傳統(tǒng)分類方法將煙草屬分為14個組[1,3]，而以植物細胞核和質(zhì)體基因組區(qū)域特點為依據(jù)的分類方法將煙草屬分為13個組[2,4]，且組內(nèi)的成員也存在較大差異。2）可能是煙草屬內(nèi)的各個種多數(shù)是通過復雜的組間雜交而形成的[1-5]，各個種之間的親緣關系錯綜復雜。3）可能是分子標記的不同而導致聚類分析結果的不同。比如AFLP標記，受限制性內(nèi)切酶種類等選擇性因素的制約，不能在DNA水平上全面、真實地揭示出個體間的差異，導致其在聚類分析中的結果不如SSR標記的準確[34-36]。

綜上所述，細胞器基因組SSR標記不僅具有核基因組SSR標記的特異、穩(wěn)定、可重復、共顯等固有優(yōu)點，且還具有較高的種屬通用性，因而更適合在種間或更高分類級別上對煙草屬的起源、進化、分類及種質(zhì)資源多樣性分析等進行研究；但因其在同一物種內(nèi)（種內(nèi)）各品種間的遺傳多態(tài)性檢測效率極低而不適合種內(nèi)聚類分析研究。

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Genetic diversity analysis of genusNicotianabased on SSR markers in chloroplast genome and mitochondria genome

ZENG Jianmin，CHEN Xuejun，WU Xingfu，JIAO Fangchan，XIAO Bingguang， LI Yongping，TONG Zhijun
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China

Based on SSR markers in chloroplast genome and mitochondrial genome of tobacco, genetic diversity of 35 wild tobacco germplasm belonging to 3 subgenus and 9 sections was first analyzed in this study. 20 primer pairs were selected from 764 tobacco organelle genomic SSR markers which were previously developed by lab. A total of 176 polymorphic bands were ampli fi ed in 35 wildNicotianaspecies using 20 SSR primers, and the number of polymorphic bands detected by each SSR primer ranged from 2 to 19, with an average of 8.8 polymorphic bands per marker. Genetic similarity coefficient (GS) among the 35 wildNicotianaspecies ranged from 0.20 to 1.00, with an average of 0.57, which indicated the genetic variation of the 35 wildNicotianaspecies was quite large and the genetic diversity was much abundant inNicotianagenus. Except forSuaveolentessection, the 35 wildNicotianaspecies were clustered into 7 categories by an appropriate genetic similarity coefficient, while the boundary of three subgenus was not obvious. Results indicated that two kinds of tobacco organelle genomic SSR markers in this study are suitable for the evolution, classi fi cation, and genetic analysis among di ff erent tobacco species.

wild tobacco; genetic diversity; simple sequence repeat (SSR) markers

曾建敏，陳學軍，吳興富，等. 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標記的煙屬植物遺傳多樣性分析[J]. 中國煙草學報，2016, 22（4）

中國煙草總公司項目（110201402002、110201302005）;中國煙草總公司云南省公司項目（2014YN04、2013YN09）

曾建敏（1977—），博士，主要從事煙草育種研究，Email：jmzeng@yntsti.com

童治軍（1980—），博士，主要從事煙草育種與生物技術研究，Email: tzj861@163.com

2016-04-07

：ZENG Jianmin，CHEN Xuejun，WU Xingfu，et al. Genetic diversity analysis of genusNicotianabased on SSR markers in chloroplast genome and mitochondria genome [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)