楊靖，毛多斌，陳芝飛，孫志濤，郝輝，賈春曉，李成剛，王高杰，馬宇平

1 鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州市東風(fēng)路5號 450002；2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市隴海路72號 450000

GC-MS/O技術(shù)測定卷煙煙氣中巨豆三烯酮的香氣活力值

楊靖1，毛多斌1，陳芝飛2，孫志濤2，郝輝2，賈春曉1，李成剛2，王高杰2，馬宇平2

1 鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州市東風(fēng)路5號 450002；2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市隴海路72號 450000

以同時(shí)蒸餾萃取法萃取卷煙主流煙氣粒相物，利用半制備高效液相色譜法制備含有巨豆三烯酮餾分，采用GC-MS/O技術(shù)測定巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體在卷煙煙氣中的含量和嗅覺閾值，從而獲得了相應(yīng)香味化合物的香氣活力值（OAV）。結(jié)果表明：①巨豆三烯酮a、b、c和d的嗅覺閾值分別為0.81 ng/mL、2.05 ng/mL、3.86 ng/mL和0.88 ng/mL；②巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的OAV大小順序?yàn)椋壕薅谷┩猟（75.58）＞巨豆三烯酮 b（35.35）＞巨豆三烯酮 a（23.01）＞巨豆三烯酮c（2.36）；③利用GC-MS/O技術(shù)，可獲得化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定或存在多種同分異構(gòu)體的香味物質(zhì)OAV，解決了傳統(tǒng)方法無法準(zhǔn)確測定的問題。

GC-MS/O；香氣活力值；嗅覺閾值；巨豆三烯酮

香氣活力值（Odor activity value，OAV）是指香氣化合物在香味體系中的濃度與其嗅覺閾值的比值[1]。當(dāng)OAV 超過（含）1 時(shí)，表明香氣化合物對香味體系的香氣有貢獻(xiàn)，其值越高貢獻(xiàn)越大，反之，則其對香氣貢獻(xiàn)可以忽略[2]。對于卷煙煙氣而言，通過比較其中不同香味化合物的OAV大小，可判別哪些香味化合物對卷煙香氣特征起關(guān)鍵作用，區(qū)分不同香味化合物對卷煙香氣的貢獻(xiàn)程度。

嗅覺閾值指香味化合物在一定介質(zhì)中被人嗅覺系統(tǒng)所感受到的最低濃度值，通常采用無味的溶劑將香味化合物進(jìn)行稀釋后，由受過訓(xùn)練的專業(yè)人員嗅辨而得。這種嗅覺閾值的評定方法適合于高純度的標(biāo)準(zhǔn)品，但對結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定、純度達(dá)不到要求或是含有多種同分異構(gòu)體的香味物質(zhì)，則無法直接采用此方法獲得其嗅覺閾值。GC-MS/O（Gas Chromatography-Mass Spectrometer/Olfactometry）技術(shù)是將氣相色譜和人體感官相結(jié)合的一種分析方法[3]，即在氣相色譜柱末端添加一個(gè)分流裝置，將分離后的一部分化合物進(jìn)入質(zhì)譜檢測器進(jìn)行檢測分析，而另一部分則流經(jīng)嗅辨儀，由嗅辨員對該化合物進(jìn)行嗅聞分析[4]。該技術(shù)的優(yōu)勢在于測試樣品經(jīng)氣相色譜柱分離成為單一化合物，消除了雜質(zhì)和溶劑對該化合物的影響。國內(nèi)外不少學(xué)者已采用此技術(shù)對食品和煙草中致香成分香氣特征進(jìn)行了研究[5-15]，但未見采用GC-MS/O技術(shù)測定煙草致香成分香氣活力值的研究報(bào)道。

巨豆三烯酮是卷煙重要中性香味成分，具有煙草香和辛香底韻，能顯著增強(qiáng)煙香、改善吸味、調(diào)和煙氣、減少刺激性，是卷煙調(diào)香不可缺少的香原料?？緹熤芯薅谷┩颗c中性香氣成分含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[16]，在不同品種和等級煙葉中其4種異構(gòu)體含量也不同[17-22]。由于巨豆三烯酮是含4種同分異構(gòu)體的混合物，采用傳統(tǒng)方法無法準(zhǔn)確獲得四者的嗅覺閾值。因此，利用GC-MS/O技術(shù)對卷煙煙氣中巨豆三烯酮的嗅覺閾值進(jìn)行測定研究，獲得巨豆三烯酮在卷煙煙氣中的香氣活力值，旨在為此類技術(shù)在卷煙中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為卷煙調(diào)香技術(shù)深入開展提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

黃金葉品牌“大金圓”成品卷煙（河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供）。

無水乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸苯乙酯、二氯甲烷（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），巨豆三烯酮（純度96%，4種異構(gòu)體混合物，美國Sigma公司）。

RM20H吸煙機(jī)（德國Borgwaldt kc公司）；6890/5973N 型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國 Agilent公司）；Waters 600型高效液相色譜儀（沃特世科技（上海）有限公司）；精密電子天平（感量：0.0001g；上海賽多利斯天平儀器廠）；Sniffer 9000 型嗅辨儀（瑞士Brechbühler公司）。

1.2 方法

1.2.1 前處理

挑取黃金葉“大金圓”成品卷煙50支，采用RM20H吸煙機(jī)按GB/T 19609-2004標(biāo)準(zhǔn)對卷煙中的粒相物進(jìn)行捕集，每支煙捕集8口主流煙氣，將捕集后的劍橋?yàn)V片置于 1000mL圓底燒瓶中，隨后加入500mL的超純水，在同時(shí)蒸餾萃取裝置的另一端連接1個(gè)250mL圓底燒瓶，加入100mL色譜純的二氯甲烷進(jìn)行同時(shí)蒸餾萃取，加熱萃取時(shí)間2.5 h，得到二氯甲烷萃取液。用5%(體積百分比，下同)鹽酸水溶液 (20 mL×5)洗滌，合并鹽酸洗滌液，用二氯甲烷（20 mL×3）反萃，合并有機(jī)相；再用5%氫氧化鈉水溶液(20 mL×5)洗滌有機(jī)相，合并氫氧化鈉洗滌液，用二氯甲烷（20 mL×3）反萃取，合并有機(jī)相，即得到中性香氣成分萃取液。加入適量無水硫酸鈉干燥過夜，然后過濾減壓濃縮至1 mL，備用。

1.2.2 樣品的分離制備

將濃縮后的中性香氣成分萃取液采用半制備型HPLC進(jìn)行分離，色譜柱條件：SunFire Silica硅膠柱(10 μm×10 mm×250 mm)（美國沃特世Waters公司）；檢測器：Waters 2489紫外-可見光檢測器；檢測波長：254 nm；柱溫：20 ℃；流動(dòng)相和洗脫條件見表1。每10 min收集1個(gè)餾分，共收集10個(gè)，分別標(biāo)記為餾分1 ～ 餾分10，分別過濾減壓濃縮至1 mL，并利用GC/MS對其進(jìn)行定性定量分析，確定含有巨豆三烯酮的餾分及其含量。

表1 HPLC洗脫條件Tab. 1 Elution conditions of HPLC

1.2.3 巨豆三烯酮含量的測定

稱取一定量的乙酸苯乙酯用二氯甲烷定容到50 mL得內(nèi)標(biāo)溶液，再分別稱取一定量的巨豆三烯酮用二氯甲烷定容至50 mL得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后用移液管分別準(zhǔn)確量取0.05、0.10、0.50、1.00、3.00和5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的容量瓶中，加入1mL內(nèi)標(biāo)后用二氯甲烷定容，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，相對面積為縱坐標(biāo)，繪制樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。巨豆三烯酮在主流煙氣中的濃度按照公式（1）計(jì)算。

式中：X—巨豆三烯酮在主流煙氣中的濃度（ng/mL)

M—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的巨豆三烯酮在每支煙主流煙氣中的量（μg)

8—每支卷煙的抽吸口數(shù)

35—每口的抽吸容量（mL)

GC/MS分析條件如下：

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m × 250 μm,1 μm)；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣；柱流量：1.8 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：10:1；升溫程序?yàn)椋?0 ℃（15 min） 6 ℃/min 140 ℃（5min） 2℃/min 150 ℃（5 min） 3 ℃/min 210 ℃ (10min）；離子源溫度：280 ℃；電離方式：EI；電子能量：70 eV；質(zhì)量掃描范圍：33～500amu。

1.2.4 嗅覺閾值的測定

1.2.4.1 嗅覺閾值評價(jià)要求

嗅辨員應(yīng)為18～45歲，嗅覺器官無疾病的男性或者女性，經(jīng)嗅覺測試合格者；嗅辨員當(dāng)天不能攜帶或使用有氣味的香料和化妝品，不能食用有刺激氣味的食品；嗅聞室內(nèi)通風(fēng)條件良好并保持17～25℃。

1.2.4.2 評價(jià)訓(xùn)練

嗅辨員首先反復(fù)嗅聞巨豆三烯酮（4種異構(gòu)體混合物）樣品以掌握其香氣特征，然后將制備的樣品按照1/3n梯度進(jìn)行稀釋后進(jìn)樣，在GC-MS/O上采用芳香萃取物稀釋分析法（AEDA）進(jìn)行練習(xí)[9-11]，嗅辨從低濃度到高濃度進(jìn)行，GC毛細(xì)管的流出物被1:1分流，一部分進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，一部分進(jìn)入嗅覺端口被嗅辨員吸聞，質(zhì)譜檢測與嗅辨同時(shí)進(jìn)行，聞到的氣味即為所檢測到物質(zhì)的氣味，反復(fù)訓(xùn)練以培養(yǎng)嗅辨員在儀器上的嗅辨感覺及嗅辨技巧。

1.2.4.3 GC-MS/O操作條件

GC-MS條件參照1.2.3；嗅辨儀條件：ODP端口分流比：1:1；ODP溫度300℃，補(bǔ)充氮?dú)猓魉?0 mL/min。

1.2.4.4 嗅覺閾值的辨識

將利用半制備HPLC處理獲得的含有巨豆三烯酮的餾分濃縮定量后，按照1/3n梯度進(jìn)行稀釋，得到不同濃度樣品溶液，按照1.2.4.3操作條件進(jìn)樣，同時(shí)由嗅辨員在GC-MS/O嗅覺端口嗅辨。巨豆三烯酮在嗅覺端口的濃度按照公式（2）計(jì)算。

式中：A—嗅覺端口的目標(biāo)物濃度（ng/mL) ;

Y1—ODP端口的樣品溶液進(jìn)樣量（μL);

Y2—在樣品溶液中的目標(biāo)物濃度（μg/mL);

Z1—ODP載氣流速（mL/min);

Z2—目標(biāo)物出峰時(shí)長（min)。

嗅辨員在嗅聞時(shí)只需分辨出有氣味或無氣味兩種狀態(tài)，將結(jié)果列入香料嗅覺閾值評價(jià)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表中。對照顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表[23]判別評價(jià)結(jié)果：當(dāng)答對人數(shù)小于表中的人數(shù)時(shí)，表明該香料樣品濃度在閾值之下，否則在閾值之上。重復(fù)嗅辨，直至找到相鄰的兩個(gè)濃度（即低濃度與高濃度之比為1:3，下同），其中一個(gè)濃度在作用閾值以上，另一個(gè)濃度在閾值以下，初步確定該香味化合物嗅覺閾值介于上述兩個(gè)濃度之間。然后，按照黃金分割法由高向低分割濃度并進(jìn)行嗅辨，直至高低兩個(gè)濃度處于同一個(gè)數(shù)量級，取高濃度點(diǎn)作為該香味化合物的嗅覺閾值。

1.2.5 OAV值的計(jì)算

按照公式（3）計(jì)算目標(biāo)香味化合物的OAV。

2 結(jié)果與討論

2.1 定量分析

2.1.1 工作曲線

4種巨豆三烯酮同分異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab. 2 Linear equations, correlation coefficients and linear ranges

從表2可以看出，在所測定的濃度范圍內(nèi)，巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.999以上，說明4種樣品標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線的相關(guān)性很好；其線性范圍較寬，可以滿足定量分析測試要求。巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.27%、3.11%、4.59%和1.38%，均小于8%；加標(biāo)回收率介于89%和108%之間，說明該方法精確度好，適合進(jìn)行定量測定；4個(gè)樣品最大檢測限為13.49 ng/mL，遠(yuǎn)低于卷煙煙氣中巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的含量，可以滿足定量分析測試要求。

2.1.2 分析結(jié)果

將HPLC分離制備出的10個(gè)餾分分別進(jìn)行GC/MS分析，結(jié)果表明，只在餾分9中檢測出巨豆三烯酮。巨豆三烯酮餾分的GC/MS總離子流分別見圖1。

圖1 巨豆三烯酮的GC-MS總離子流圖Fig. 1 TIC chromatogram of megastigmatrienone by GC-MS

巨豆三烯酮的含量進(jìn)行了6次平行測定，結(jié)果取平均值。結(jié)果表明，分析樣品中巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的含量分別為260.9 μg、1014.6 μg、127.4 μg和931.1 μg。因此，由公式（1）可以計(jì)算出每支卷煙主流煙氣中中巨豆三烯酮4種異構(gòu)體的含量分別為18.64 ng/mL、72.46 ng/mL、9.11 ng/mL和66.51 ng/mL。

2.2 嗅覺閾值的評定

將巨豆三烯酮餾分按照1/3n的比例進(jìn)行梯度稀釋，獲得4個(gè)不同濃度的巨豆三烯酮溶液，見表3。

按照1.2.4.3操作條件進(jìn)樣，同時(shí)由嗅辨員在GCMS/O嗅覺端口嗅辨，嗅覺端口的巨豆三烯酮濃度按照公式（2）計(jì)算，結(jié)果見表4。

表3 巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的濃度Tab. 3 Concentrations of four isomers of megastigmatrienone

表4 巨豆三烯酮的嗅覺閾值評定結(jié)果Tab. 4 Evaluation results of odor threshold values of megastigmatrienone

表4結(jié)果顯示，巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的嗅覺閾值范圍分別為0.63 ～ 1.88 ng/mL、0.68 ～ 2.05 ng/mL、1.29 ～ 3.86 ng/mL和0.68 ～ 2.04 ng/mL。按照黃金分割法由高濃度向低濃度進(jìn)行分割，獲得黃金分割點(diǎn)濃度的溶液，其中巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體濃度分別為51.1 μg/mL、66.3 μg/mL、74.9 μg/mL和60.8 μg/mL。然后，再次進(jìn)行嗅辨，結(jié)果見表5。

綜合表4和表5評價(jià)結(jié)果，巨豆三烯酮a的嗅覺閾值介于0.63 ～ 1.11 ng/mL，巨豆三烯酮b介于1.21～ 2.05 ng/mL，巨豆三烯酮c介于2.27 ～ 3.86 ng/mL，巨豆三烯酮d介于0.68 ～ 1.20 ng/mL。其中，巨豆三烯酮b和c的嗅覺閾值上下兩個(gè)濃度處于同一數(shù)量級，可以確定此二者的嗅覺閾值；而巨豆三烯酮a和d尚未處于同一數(shù)量級，還需按照黃金分割法由高濃度向低濃度對其進(jìn)一步分割，分別獲得二者濃度分別為37.4 μg/mL和44.5 μg/mL的溶液，再次進(jìn)行嗅辨，評定結(jié)果見表6。

表5 巨豆三烯酮的嗅覺閾值評定結(jié)果Tab. 5 Evaluation results of odor threshold values of megastigmatrienone

表6 巨豆三烯酮a和d的嗅覺閾值評定結(jié)果Tab. 6 Evaluation results of odor threshold values of megastigmatrienone a and d

由表5和表6可知，巨豆三烯酮a的嗅覺閾值介于0.63 ～ 0.81ng/mL，巨豆三烯酮d介于是0.68 ～0.88ng/mL，此二者嗅覺閾值上下兩個(gè)濃度已處于同一數(shù)量級。

因此，綜合以上分析結(jié)果，巨豆三烯酮4種同分異構(gòu)體的嗅覺閾值分別為0.81 ng/mL、2.05 ng/mL、3.86 ng/mL和0.88 ng/mL。

2.3 香氣活力值的確定

根據(jù)巨豆三烯酮在卷煙煙氣中的嗅覺閾值及含量，分別計(jì)算其在卷煙煙氣中的OAV，結(jié)果見表7。

表7 巨豆三烯酮的OAVTab. 7 OAV of megastigmatrienone

表7結(jié)果顯示，巨豆三烯酮a、b、c和d的OAV均大于1，說明其對黃金葉“大金圓”卷煙香氣具有顯著貢獻(xiàn)；4種香味化合物對卷煙香氣的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋壕薅谷┩猟＞巨豆三烯酮b＞巨豆三烯酮a＞巨豆三烯酮c。

3 結(jié)論

采用同時(shí)蒸餾萃取法萃取黃金葉“大金圓”卷煙煙氣主流粒相物，經(jīng)酸堿洗滌和反相萃取后，再利用半制備高效液相色譜法進(jìn)行分離，制備含有巨豆三烯酮的餾分。以此餾分為研究對象，采用GC-MS/O技術(shù)進(jìn)行嗅覺閾值測定，結(jié)果顯示，巨豆三烯酮a、b、c和d的嗅覺閾值分別為0.81 ng/mL、2.05 ng/mL、3.86 ng/mL和0.88 ng/mL。同時(shí)，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明主流煙氣中4種同分異構(gòu)體的含量分別為18.64 ng/mL、72.46 ng/mL、9.11 ng/mL和66.51 ng/mL。由此，獲得相應(yīng)的OAV分別為23.01、35.35、2.36和75.58，表明4種同分異構(gòu)體對黃金葉“大金圓”卷煙香氣均有顯著貢獻(xiàn)，貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋壕薅谷┩猟＞巨豆三烯酮b＞巨豆三烯酮a＞巨豆三烯酮c。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)方法無法準(zhǔn)確測定存在多種同分異構(gòu)體或化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的香味物質(zhì)OAV的問題。

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Abstrac:Simultaneous distillation and extraction was applied to handle cigarette mainstream smoke particles, and fractions containing megastigmatrienone were prepared using Semi-preparation HPLC. Contents and odor threshold values of megastigmatrienone in tobacco smoke were determined by GC-MS/O respectively, and odor active values (OAV) were obtained. Results showed that: 1) Odor threshold value of four isomers of megastigmatrienone was 0.81 ng/Ml, 2.05 ng/mL, 3.86 ng/mL and 0.88 ng/mL respectively. 2) OAVs of four isomers of megastigmatrienone were in the order of megastigmatrienone d (75.58) ＞ megastigmatrienone b (35.35) ＞ megastigmatrienone a (23.01) ＞ megastigmatrienone c (2.36). 3) Odor threshold values of flavoring substances which possessed unstable chemical properties or several isomers could be determined accurately by using GC-MS/O technology, and hence the odor active values (OAV) in the cigarette smoke. The technology boasted accurate determination of OAVs of flavoring substances compared with traditional methods.

Determination of odor active values of megastigmatrienone in cigarette mainstream smoke by GC-MS/O

YANG Jing1， MAO Duobin1，CHEN Zhifei2，SUN Zhitao2，HAO Hui，JIA Chunxiao1，LI Chenggang2，WANG Gaojie2， MA Yuping2
1 School of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China;2 Technology Center, China Tobacco Henan Industrial Co., Ltd., Zhengzhou 450000, China

GC-MS/O; odor active value; odor threshold values; megastigmatrienone

楊靖，毛多斌，陳芝飛，等. GC-MS/O技術(shù)測定卷煙煙氣中巨豆三烯酮的香氣活力值[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2016,22（6）

楊 靖（1972—），碩士，副教授，主要從事煙草化學(xué)與香精香料研究工作，Email: y0ung@126.com

陳芝飛（1979—），碩士，副研究員，主要從事卷煙調(diào)香和煙草化學(xué)研究，Email: chenzhfei@126.com

2015-11-18

:YANG Jing, MAO Duobin,CHEN Zhifei, et al. Determination of odor active values of megastigmatrienone in cigarette mainstream smoke by GC-MS/O[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(6)