江　毅　楊佰雨　孔維歡　王大軍　趙月龍　劉盼召　冉大鵬　趙浩　周劉濤　何　雷

(河南科技太學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室,河南洛陽　471003)

TGEV-PEDV二重RT-PCR檢測方法的建立及應用

江毅楊佰雨孔維歡王大軍趙月龍劉盼召冉大鵬趙浩周劉濤何雷*

(河南科技太學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室,河南洛陽471003)

本試驗旨在建立能同時檢測豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的二重RT-PCR檢測方法.首先根據(jù)GenBank收錄的TGEV和PEDV的基因序列,設計擴增豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的特異性引物,然后通過優(yōu)化二重PCR的體系建立一個二重RT-PCR檢測方法.用該方法對臨床收集的10份糞便樣品進行檢測,初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特異性和靈敏度,能用于臨床診斷及流行病學調(diào)查。

豬傳染性胃腸炎病毒豬流行性腹瀉病毒多重PCR診斷

1　材料與方法

1.1試驗材病毒與病料

豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)細胞分離毒株和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)病料以及采集的疑似病毒性腹瀉糞便樣品.由河南科技大學預防獸醫(yī)檢疫實驗室保存。

1.2單項PCR擴增cDNA

取200uL病毒液樣品按照病毒RNA提取試劑盒分別提取TGEV和PEDV的病毒RNA.進行RT-PCR反應,退火溫度分別為(PEDV 55℃,TGEV 57℃),引物序列為.隨后將目的片段進行序列測定。

1.3多重PCR的建立

在單對引物擴增成功的基礎上,將目的片段加入同一PCR反應體系中配制二重PCR反應混合液.退火溫度分別為57℃.同時,對多重PCR反應體系的引物濃度、退火溫度等進行優(yōu)化。

1.4特異性試驗

參照2.2方法分別對PRRSV、CSFV、PCV等,進行RNA和DNA的提取,以該系統(tǒng)所建立的PCR體系和引物通過RT-PCR和PCR擴增,同時設PEDV和TGEV細胞毒混合物為陽性對照,以檢驗該方法的特異性。

19周齡4個處理組雞體重和脛長見表4。由表4可以看出，育成期不同的蛋白質水平對雞體重和脛長造成的影響，在統(tǒng)一日糧后，飼喂5周，即蛋雞在19周齡時各處理的體重和脛長已無顯著差異（P＞0.05）。

1.5敏感性試驗

將TGEV和PEDV細胞毒株混合物為陽性對照.調(diào)整核酸濃度,按l0倍以內(nèi)的濃度梯度稀釋,按優(yōu)化的多重PCR反應體系進行PCR擴增。

1.6多重PCR方法的臨床應用

取本實驗室所采集的疑似病毒性腹瀉糞便為樣品,按照上述方法建立的多重PCR技術,檢測TGEV和PEDV。

2　結果與分析

2.1TGEV-PEDV二重PCR檢測體系的建立與優(yōu)化

首先本研究通過對病料組織的RNA的提取,并通過RT-PCR的方法擴增了PEDV和TGEV基因片段.在上述研究的基礎上,本研究以TGEV和PEDV的回收產(chǎn)物為模板,設計TGEV和PEDV特異性擴增引物進行了PCR擴展(圖2),電泳結果表明,擴增產(chǎn)物符合預期目的片段,對其優(yōu)化結果表明,最佳退火溫度為57℃。

圖1　TGEV-PEDV二重PCR凝膠電泳圖

圖2　TGEV-PEDV多重PCR的特異性試驗檢測結果

2.2特異性試驗結果

分別對PRRSV、CSFV、PCV等進行了RNA和DNA的提取,以該系統(tǒng)所建立的多重PCR體系進行擴增,特異性實驗結果表明,該PCR體系對PRRSV、CSFV、PCV均無擴增(圖3),說明所建立的PCR體系特異性強。

2.3敏感性試驗結果

將目的片段的核酸分別作稀釋,使其濃度分別為100ng、50ng、10ng、5ng、1ng、0.5ng和0.1ng的總量,并以此作為擴增模板,結果表明,核酸量為100ng,50ng,10ng和5ng和1ng能擴增出特異性條帶,而PEDV和TGEV的核酸為0.5ng的僅能擴增微弱的條帶;的沒有擴增條帶.因此該PCR體系的靈敏性為0.1ng/uL。

2.4多重PCR臨床檢測初步應用

以建立的二重PCR方法檢測采集的臨床8份樣品進行了檢測,見圖3,結果表明3份為PEDV陽性,2份為TGEV陽性,沒有檢測到混合感染的病例。

圖3　多重PCR臨床初步應用檢測結果

3　討論

豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒感染是仔豬的常見疾病,發(fā)病率高,目前均沒有有效的藥物,且兩者在臨床癥狀、流行病學和病理變化上無明顯差異.嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展.臨床上此兩種病往往混合感染.RT-PCR技術目前是鑒別診斷上述病毒病原的最敏感、特異的方法。

多重PCR技術在同一體系中實現(xiàn)多個目標基因的特異性擴增,但并非單一PCR簡單混合.引物設計是其中一個關鍵因素.除了考慮每對引物的特異性及擴增效率之外.還必須盡量減少引物對之間形成二聚體的可能,此外,還須對各對引物濃度配比、退火溫度及其他PCR反應條件進行優(yōu)化.相對于傳統(tǒng)PCR檢測單一病原體,多重PCR能同時進行多種病原微生物的鑒定,且具有靈敏、快捷等特點,適于大規(guī)模檢測,在動物疫病的流行病學的調(diào)查與預防中,具有不可替代的作用.本文針對TGEV和PEDV基因序列,擴增了2個特異性片段,長度分別為500bp和750bp目的片段之間具有明顯的長度差異,便于鑒別,且單對引物的擴增特異性強,擴增效率高,為在獸醫(yī)臨床中PEDV和TGEV的實驗室診斷提供了技術手段。

河南科技大學實驗開發(fā)基金(SY1314047)和大學生研究訓練計劃(SRTP)項目(2014265)支持。

江毅(1995-),男,河南洛陽人,本科學歷,主要研究方向:分子病原學和免疫學。

何雷(1983-),男,河南南陽人,博士學歷,講師,研究方向:分子病原學和免疫學。