吐爾洪·阿木提阿布力孜·吾斯曼宋玉坤張效生王旭光何長久傅祥偉朱士恩張金龍*劉國世，*

（1.新疆阿克蘇市畜禽育種改良站，新疆阿克蘇 843000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 8300522；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

黑頭薩福克綿羊胚胎玻璃化快速凍胚移植效果分析

吐爾洪·阿木提1阿布力孜·吾斯曼3宋玉坤2張效生4王旭光3何長久2傅祥偉2朱士恩2張金龍4*劉國世2，3*

（1.新疆阿克蘇市畜禽育種改良站，新疆阿克蘇 843000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 8300522；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

本試驗(yàn)應(yīng)用玻璃化胚胎冷凍方法進(jìn)行黑頭薩福克綿羊胚胎冷凍和移植，比較了受體羊卵巢上黃體數(shù)量、受體羊的體況、移植胚胎的數(shù)量對受體受胎率的影響。受體羊卵巢上有一個(gè)黃體的移植受胎率42.7%與有2～3個(gè)黃體受體羊移植受胎率44.4%無顯著差異；受體的體況對受胎率有顯著影響，中上等（含中等）體況水平的受體的受胎率47.2%顯著高于中下等的受體的受胎率43.0% （P＜0.05）；使用玻璃化胚胎冷凍法的冷凍解凍胚胎移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0%（P＜0.05）；移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%（P＞0.05）。因此，受體羊黃體數(shù)、冷凍桑葚胚和囊胚對胚胎移植受胎率沒有顯著影響，而受體中上等（含中等）體況水平和玻璃化胚胎冷凍法冷凍解凍胚胎移植受胎率顯著提高。

綿羊胚胎玻璃化冷凍胚胎移植胚胎階段受胎率

胚胎的冷凍保存是動(dòng)物繁殖及生物工程的關(guān)鍵應(yīng)用技術(shù)之一。將質(zhì)量較好的胚胎進(jìn)行冷凍保存，同期發(fā)情后胚胎移植技術(shù)的結(jié)合，不僅可以起到保存瀕危動(dòng)物的品種，還可以使動(dòng)物引種不再受地點(diǎn)和時(shí)間條件的局限，提高了胚胎移植的推廣應(yīng)用。玻璃化冷凍是繼程序化冷凍之后發(fā)明的一種簡單高效的冷凍方法，無須經(jīng)歷緩慢的程序化降溫過程，細(xì)胞在玻璃化液中短暫處理后直接投入液氮冷凍即可。玻璃化冷凍相對程序化冷凍大大降低昂貴的冷凍儀，冷凍過程耗時(shí)較短，便于推廣應(yīng)用。新疆阿克蘇地區(qū)，近幾年逐步加大了對當(dāng)?shù)囟嗬搜虻母牧剂Χ?，?015 年利用當(dāng)?shù)氐亩嗬搜蜃鍪荏w進(jìn)行胚胎移植，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種羊，向農(nóng)牧民提供質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的種公羊。本文旨在通過試驗(yàn)探討受體羊的飼養(yǎng)管理水平、胚胎胚齡、胚胎冷凍方法等因素對多浪羊胚胎移植受胎率的影響，為今后胚胎移植技術(shù)在該地的推廣、提高胚胎移植受胎率提供參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2015年在新疆阿克蘇富民養(yǎng)殖場進(jìn)行。

1.1.2受體母羊的準(zhǔn)備與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選用新疆當(dāng)?shù)仄贩N年齡1.5～4歲的多浪羊。所有的試驗(yàn)羊已經(jīng)做過預(yù)飼養(yǎng)、驅(qū)蟲、免疫，體格健壯，無遺傳及傳染性疾病、寄生蟲病、生殖系統(tǒng)疾病等，具有正常發(fā)情周期。受體羊在舍飼情況下要保證有良好的體況。

1.1.3藥品與試劑

促卵泡素（FSH）：三生藥業(yè)有限公司

促黃體激素釋放激素（A3）：三生藥業(yè)有限公司

孕馬血清促性腺激素（PMSG）：三生藥業(yè)有限公司

陰道栓（CIDR）：新西蘭CIDR，20個(gè)/袋

Holding培養(yǎng)液：新西蘭生產(chǎn)，50ml/袋

0.5mol/L蔗糖液：美國ICP公司生產(chǎn)，6ml/支

玻璃化冷凍液：實(shí)驗(yàn)室自配

酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水、青霉素、鏈霉素等為國產(chǎn)。

1.1.4設(shè)備及器械

胚胎移植針，細(xì)菌濾器，體視鏡，恒溫臺(tái)，水浴鍋等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1玻璃化胚胎冷凍保存及解凍方法

（1）冷凍：胚胎首先在10%EG或10%EG+10%D預(yù)處理液中平衡5min，然后針用撿卵將胚胎移進(jìn)事先裝好玻璃化溶液的0.25ml塑料細(xì)管內(nèi)，平衡30s后投進(jìn)液氮容器內(nèi)冷凍保存。

（2）解凍：在25℃室溫下，將裝有胚胎的細(xì)管從液氮中取出，迅速放入25℃水浴中平行晃動(dòng)10s，待細(xì)管內(nèi)蔗糖部分由乳白變?yōu)橥该鲿r(shí)，取出細(xì)管，搽去細(xì)管表面的水珠，剪掉兩端口，將細(xì)管內(nèi)的液體推入0.5mol/L蔗糖液的表面皿中，在實(shí)體顯微鏡下找到胚胎，并將胚胎移入放有0.5mol/L蔗糖液的平皿中平衡5.0min去除抗凍保護(hù)劑，最后用PBS液洗凈胚胎，移入Holding液中等待移植。

1.2.2受體羊同期發(fā)情方法

多浪羊受體在發(fā)情周期任意一天放置CIDR，第13d注射PMSG，同時(shí)取出CIDR，并進(jìn)行記錄。受體羊發(fā)情后用腹腔內(nèi)窺鏡法進(jìn)行冷凍胚胎移植，見表1。

表1　受體羊冷凍胚胎移植方案

1.2.3卵巢上黃體個(gè)數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

多浪羊受體選擇要求健康，無繁殖疾病，同期發(fā)情前一個(gè)月進(jìn)行補(bǔ)飼，使之達(dá)到最佳的生理狀態(tài)，為保證后期高的同期發(fā)情率和受胎率。在試驗(yàn)中比較雙側(cè)卵巢上有一個(gè)黃體的受體和卵巢上有2-3個(gè)黃體對受體移植受胎率的影響。

1.2.4受體的體況對冷凍胚胎移植效果的影響

對本試驗(yàn)選擇不同體況的多浪羊受體（中上等、中下等）進(jìn)行同期發(fā)情處理，比較受體體況對冷凍胚胎移植效果的影響。羊的體況按照體重分為中上、中下等體況，體況按照年齡、體重區(qū)分見表2。

表2　按照體重劃分羊的體況表

1.2.5不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

本試驗(yàn)選用兩種不同冷凍方法生產(chǎn)的冷凍胚胎（常規(guī)冷凍法和玻璃化法），胚胎解凍后每只羊移植1枚胚胎，其他條件相同的前提下移植到同期發(fā)情處理的多浪羊子宮角內(nèi)，觀察比較其受孕情況。

1.2.6不同胚齡對冷凍胚胎受胎率的影響

本試驗(yàn)選擇常規(guī)胚胎冷凍法冷凍的凍胚251枚，分別移植給251只多浪受體羊，比較移植1枚桑葚胚和移植1枚囊胚受胎率情況。

1.2.7數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel2003軟件進(jìn)行整理，試驗(yàn)結(jié)果采用SAS軟件中的PROCFREQ統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1卵巢不同黃體個(gè)數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

本試驗(yàn)比較了多浪羊的雙側(cè)卵巢上有1個(gè)黃體或有2個(gè)及以上黃體，冷凍胚胎移植后受胎率，由表3可知，受體羊卵巢上有1個(gè)黃體的移植受胎率42.7%，有2-3個(gè)黃體受體羊移植受胎率44.4%，兩組受胎率差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同黃體個(gè)數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

2.2受體體況對冷凍胚胎移植效果的影響

由表4可見，受體的體況對受胎率有顯著影響，中上等（含中等）體況水平的受體的受胎率47.2%顯著高于中下等的受體的受胎率43.0%（P＜0.05）。

表4　受體體況對受胎率的影響

2.3不同胚齡對冷凍胚胎受胎率的影響

由表5可知，不同胚齡對冷凍胚胎受胎率有顯著影響，移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%（P＞0.05）。

表5 不同胚齡對冷凍胚胎移植效果的影響

2.4不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

由表6可見，胚胎冷凍方法對受體的受胎率有顯著影響，使用玻璃化胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0%（P＜0.05）。

表6 不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

3　分析與討論

3.1卵巢不同黃體個(gè)數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明卵巢上黃體多少不影響移植效果，這與付靜濤等（付靜濤等，2005）和王素梅（2004）等結(jié)果相一致。受體綿羊血漿中的孕激素濃度與黃體的數(shù)量有關(guān)（Ashworth et al.，1989），孕激素的主要功能是促進(jìn)胚胎著床并維持受胎（張忠誠，2004）。但受體羊卵巢上的黃體數(shù)量對胚胎移植后的受胎率沒有顯著影響（Bari et al.，2003）。也就是說只要血漿中的孕激素達(dá)到了受胎所需的閾值就足以維持受胎了，多了效果也是一樣。所以在移植時(shí)觀察黃體要注重對黃體質(zhì)量的觀察。

3.2受體體況對冷凍胚胎移植效果的影響

受體羊的飼養(yǎng)管理十分重要。受胎率與受體羊的飼養(yǎng)管理有著直接的聯(lián)系。當(dāng)胚胎移植時(shí)受體羊的體況達(dá)到中等以上水平，大部分胚胎能夠著床發(fā)育成活。營養(yǎng)條件不足，對胚胎著床和產(chǎn)后羔羊的生長不利，顯著影響受體胚胎移植效果（張紅等，2005）。本試驗(yàn)體況中上等的受體羊的受胎率明顯好于中下等體況的受體羊，這一結(jié)果與以上等人的研究結(jié)果相符合。所以在進(jìn)行胚胎移植前，先對受體羊進(jìn)行選擇，盡量選擇體況好、體質(zhì)好的青年羊作為受體，以保證較高的受胎率。

3.3不同胚齡對冷凍胚胎受胎率的影響

一般認(rèn)為處于桑葚胚前的胚胎，移植效果好，受胎率較高。張紅等（2001）研究證明，桑葚胚移植受胎率、胚胎存活率均要高于囊胚。也有試驗(yàn)證明，囊胚期是胚胎移植的最佳時(shí)間期，且受胎非常高。王麗娟等（2003）認(rèn)為道賽特等綿羊凍胚移植中，囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（P＜0.01）；陳永昌等研究也得出杜泊羊囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（P＜0.01）。可是本試驗(yàn)的結(jié)果表明，移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%，但二者差異不顯著（P＞0.05），說明胚齡對冷凍胚胎受胎率沒有顯著影響。

3.4不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

牛胚胎常規(guī)冷凍已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，玻璃化冷凍移植產(chǎn)犢也有報(bào)道（saha et al，1996）。牛胚胎的玻璃化冷凍研究表明，第7天擴(kuò)張囊胚冷凍后可以獲得較高的存活率（80%），而桑葚胚冷凍存活率相對較低（62%）（Campos-chillon et al，2006）。eldridge-panuska等（2005）用細(xì)管法玻璃化冷凍馬胚胎，管內(nèi)解凍直接移植后獲得62%的受胎率，和對照無顯著差異。玻璃胚胎冷凍化法優(yōu)點(diǎn)是不使用冷凍儀，且在室溫（20℃～25℃）下徒手操作，僅30s即可完成冷凍程序。而常規(guī)胚胎冷凍法，需要借助冷凍儀，冷凍的所耗時(shí)間長，且降溫過程需1.5h才能完成。盡管國內(nèi)已有許多玻璃化法冷凍和解凍胚胎的研究，但多數(shù)均在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)的研究，綿羊玻璃化冷凍胚胎應(yīng)用在生產(chǎn)中報(bào)道較少。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，將玻璃化胚胎冷凍法應(yīng)用于綿羊冷凍胚胎移植，并且使用玻璃化胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0% （P＜0.0 5），所以在今后的胚胎生產(chǎn)中可推廣玻璃化胚胎冷凍法進(jìn)行胚胎冷凍保存。

因此，受體羊黃體數(shù)、冷凍桑葚胚和囊胚對胚胎移植受胎率沒有顯著影響，而受體中上等（含中等）體況水平和玻璃化胚胎冷凍法冷凍解凍胚胎移植受胎率顯著提高。

[1]付靜濤，朱士恩. 綿羊同期發(fā)情與冷凍胚胎移植技術(shù)的研究[J］.中國畜牧雜志，2005，41（8）：32-33，57.

[2]朱士恩. 家畜繁殖學(xué)（第五版）[M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[3]王麗娟，李 武，張廣民.優(yōu)質(zhì)肉羊冷凍胚胎移植技術(shù)的研究 應(yīng)用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2003，（1）：29.

[4]陳永昌，王 繼，和占星，等.杜泊羊冷凍胚胎批量移植試驗(yàn) [J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004，（10）：32-34.

課題資助：支疆項(xiàng)目（2016E02037）；國家重大專項(xiàng)（2014ZX08008-002B，2013ZX08008—005）；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)合作基金（2015TC050）