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（北京市朝陽區(qū)動物疫病預防控制中心，北京　100018）

液相色譜熒光檢測水產(chǎn)品中隱色孔雀石綠殘留的方法

郭 睿曹院章唐艷榮王艷紅王丹怡詹穎潔

（北京市朝陽區(qū)動物疫病預防控制中心，北京100018）

本文概述了隱色孔雀石綠殘留檢測的液相色譜熒光檢測方法，在實驗過程中出現(xiàn)問題的查找步驟與實驗設(shè)計，進一步解析了該實驗操作，為實驗室檢測方法的實施與改進提供參考。

隱色孔雀石綠查找步驟實驗設(shè)想

孔雀石綠（Basic Green 4）作為抗真菌劑，是抗外生性寄生蟲藥和消毒劑，被廣泛使用于魚類養(yǎng)殖業(yè)中。但是，研究顯示，孔雀石綠具有三致作用，進入人類或動物機體后，可以通過生物轉(zhuǎn)化，還原代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠，具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變作用，嚴重威脅人類身體健康，因此，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用。

1　實驗設(shè)計

本實驗室于2012年成功增項《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》，自此該項目成為實驗室重點監(jiān)測項目，“兩會”水產(chǎn)品特供保障項目。

自從2016年3月開始，該項目的檢測譜圖出現(xiàn)了明顯的異常，每批次檢測樣品的質(zhì)控樣品回收率無法達標，而且譜圖雜亂，噪音很高，檢測結(jié)果無法保證準確度。該項目只能暫時拿下，查找原因，驗證后，才能重新投入檢測。

2　出現(xiàn)問題的原因分析

2.1 檢測儀器

直接配制對照標準點，實驗室平時驗證標準溶液均使用10μg/kg濃度的隱色孔雀石綠。在現(xiàn)有儀器waters e2695+2475和waters 2695+2475上進行儀器比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩臺儀器響應(yīng)值均出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。于是按照儀器清洗程序進行維護，分別用稀硝酸和異丙醇沖洗管路過夜，經(jīng)過10μg/kg標準溶液比對，waters e2695+2475性能恢復，色譜峰響應(yīng)值可以達到初始狀態(tài)。waters 2695+2475系統(tǒng)老化，無法達到信號響應(yīng)強度，提交申請向儀器廠家報修，儀器更改相應(yīng)狀態(tài)標識。詳見圖1。

圖1　e2695+2475標準曲線

從圖中可以看出，性能恢復的waters e2695+2475檢測標準曲線，r2=0.999582，最低檢出限為0.5μg/kg，可以確定檢測儀器沒有問題。

2.2檢測試劑

重新領(lǐng)用未開封的實驗涉及的試劑，仔細核對，重新配制相關(guān)溶液，注意每一個環(huán)節(jié)，嚴格操作。使用新配制的試劑重新進行質(zhì)控實驗，采集數(shù)據(jù)，計算空白樣品添加回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果仍舊異常。詳見圖2。

圖2 自動標尺色譜圖

此次試驗操作規(guī)范，實驗過程中未發(fā)生異常，可以確定檢測試劑和實驗方法沒有問題。

2.3樣品提取步驟

使用重新配制的溶液，注意每一個環(huán)節(jié)，規(guī)范操作，重新進行質(zhì)控實驗，提取的樣液濃縮后不經(jīng)過凈化，直接溶解上機檢測，采集數(shù)據(jù)，計算空白樣品添加回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取液中有隱色孔雀石綠殘留檢出，回收量在合格范圍內(nèi)。詳見圖3。

圖3 自動標尺色譜圖

此次試驗使用的相關(guān)設(shè)備和玻璃器具均不會出現(xiàn)異常，可以確定樣品提取過程沒有問題。

2.4樣品凈化步驟

使用固相萃取裝置，直接用10g/kg標準溶液（基質(zhì)為乙腈）分別過酸性氧化鋁柱和PRS柱，分別接取過柱液、淋洗液、洗脫液，直接上機檢測，采集數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱色孔雀石綠在酸性氧化鋁過柱液中幾乎全部流出無保留，在過PRS柱后無法檢測出隱色孔雀石綠。詳見圖4。

過酸性氧化鋁柱的過柱液

圖4 自動標尺色譜圖

過PRS柱的洗脫液

圖5 自動標尺色譜圖

此次試驗可以肯定是凈化步驟出現(xiàn)問題。

（1）直接使用10g/kg標準溶液（基質(zhì)為乙腈）過PRS柱后無法在過柱液、淋洗液、洗脫液中檢測出，首先懷疑是PRS柱異?！，F(xiàn)在使用的PRS柱是Agilent公司的，于是從其他實驗室借來了VARIAN的PRS柱，使用固相萃取裝置，直接用10g/kg標準溶液（基質(zhì)為乙腈）分別過酸性氧化鋁柱和PRS柱，分別接取過柱液、淋洗液、洗脫液，直接上機檢測，采集數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱色孔雀石綠在Agilent PRS柱和VARIAN PRS柱的洗脫液中均無法檢測出隱色孔雀石綠。詳見圖6。

過Agilent PRS柱的洗脫液

圖6　自動標尺色譜圖

過VARIAN PRS柱的洗脫液。

此次試驗可以排除PRS柱的廠家差異，問題查找進入了瓶頸期。

（2）為了確定隱色孔雀石綠殘留的去向，于是設(shè)計直接采用液相方法的PRS柱后過柱液、淋洗液、洗脫液上液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，確定是否含有隱色孔雀石綠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱色孔雀石綠就殘留在洗脫液中。詳見圖8。

圖8　自動標尺色譜圖

此次試驗可以確定是凈化步驟的洗脫出現(xiàn)問題。

（3）洗脫過程排除了試劑問題、固相萃取柱問題、實驗方法問題，還會涉及的只有固相萃取裝置，于是直接使用10g/kg標準溶液（基質(zhì)為乙腈）自然過PRS柱，過柱過程中只會采用吸耳球手工吹打，收集柱后過柱液、淋洗液、洗脫液，上機檢測，采集數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液中隱色孔雀石綠幾乎全部洗脫無保留，色譜峰峰型良好。詳見圖9。

圖9　自動標尺色譜圖

此次試驗可以確定是固相萃取裝置管路年久老化，在洗脫過程中溶解了雜質(zhì)，造成色譜圖基線響應(yīng)值過高，掩蓋了目標峰的信號。

3　結(jié)語

通過此次實驗事故問題的查找步驟，更加系統(tǒng)地學習了《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》，增長了經(jīng)驗，也深切體會了日常儀器設(shè)備的維護和自檢的重要性。希望通過我實驗室的這次常規(guī)檢測項目問題查找步驟，可以給同行們的工作一些參考建議。實驗室技能的日益提高，不排除會出現(xiàn)各種各樣的問題，檢測工作的嚴謹性要求我們面對任何異常不得不求甚解，問題的出現(xiàn)是我們提高技術(shù)的契機。

圖7　自動標尺色譜圖

郭睿（1981-），職稱:中級獸醫(yī)師，研究方向:實驗室管理及檢測。

曹院章（1966-），職稱:中級獸醫(yī)師，研究方向:檢疫及獸藥殘留檢測。