朱 玲　陳 強(qiáng)　龔金秋　曾 杰　胡 男　王水蓮

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙　410128）

不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)大鼠原代間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較分析

朱 玲陳 強(qiáng)龔金秋曾 杰胡 男王水蓮

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410128）

目的:為了比較不同轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，本實(shí)驗(yàn)以大白鼠原代細(xì)胞為模型比較了兩種不同轉(zhuǎn)染試劑的效果。方法: 以pEGFP為報(bào)告基因，用兩種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察，分析兩種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果:在質(zhì)粒為0.75μg和lipofectamine3000為0.75μl情況下，lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率最高（P＜0.05），lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于lipofectamine LTX。結(jié)論:與lipofectamine LTX相比，lipofectamine3000具有轉(zhuǎn)染效率高、劑量低和操作方便的優(yōu)點(diǎn)。

大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP

睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布在曲細(xì)精管的疏松結(jié)締組織中。從青春期開(kāi)始，睪丸間質(zhì)細(xì)胞受垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的黃體生成素作用下能合成并分泌雄性激素。外源基因?qū)爰?xì)胞常用轉(zhuǎn)染的方法中應(yīng)用較多的包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和點(diǎn)穿孔法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)于儀器試劑操作要求低，是針對(duì)一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染應(yīng)用最多的轉(zhuǎn)染方法。本研究以間質(zhì)細(xì)胞為模型，用二種不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分析轉(zhuǎn)染效率，可為研究間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試劑與動(dòng)物

含GFP基因的PEGFP-N1質(zhì)粒（由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供），opti-MEM、lipofectamine LTX和lipofectamine 3000試劑，膠原酶Ⅳ、DMEM高糖和四季青血清，3β-HSD染色液（實(shí)驗(yàn)室保存）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雄性SD大白鼠（湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司）

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與處理

將大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分組，即lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染組（添加質(zhì)粒和lipofectamine LTX，用A表示）、lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染組（添加質(zhì)粒和lipofectamine 3000，用B表示）。A組依質(zhì)粒劑量與轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine LTX劑量分為A1組（0.8 μg：1 μl）、A2組（0.8 μg：2 μl）、A3組（0.8μg：3 μl）、A4組（1.0 μg：1 μl）、A5組（1.0 μg：2 μl）、A6組（1.0 μg：3 μl）、A7組（1.2 μg：1 μl）、A1組（1.2 μg：2 μl）、A1組（1.2 μg：3 μl），B組依質(zhì)粒劑量轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000劑量分為B1組（0.5 μg：0.75 μl）、B2組（0.75 μg：0.75 μl）、B3組（1.0 μg：0.75 μl）、B4組（0.5 μg：1.5 μl）、B5組（0.75μg：1.5 μl）、B6組（1.0 μg：1.5 μl）。

1.2.2間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化與效率的比較

（1）間質(zhì)細(xì)胞提取傳代

依照膠原酶濃度差異法[3］提取間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，間質(zhì)細(xì)胞傳代2次，胰酶消化后以2×105個(gè)/孔的密度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)轉(zhuǎn)染備用。

（2）試劑轉(zhuǎn)染

Lipofectamine LTX試劑不同劑量的質(zhì)粒溶解到50 μlopti-MEM中，加入1 uLlipofectamine Plus，各組不同劑量的lipofectamine LTX試劑溶解50 μlopti-MEM中，室溫靜置5 min，將兩種溶液混合，室溫靜置25 min，加入到含有500 μl無(wú)血清和雙抗的培養(yǎng)基的24孔板中，6 h后用含有血清培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置熒光顯微鏡照相并分析。同時(shí)，用lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各組質(zhì)粒溶解到25 μlopti-MEM溶液中，加入1 μl P 3000，各組不同劑量lipofectamine 3000溶解于25 uLopti-MEM中，將兩種溶液混合，室溫靜置5 min，加入到500 μl含有血清和雙抗的培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，48 h后用倒置熒光顯微鏡照相與并分析。

2　結(jié)果與分析

2.1lipofectamine LTX與lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞條件的優(yōu)化

本研究結(jié)果表明lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑中A5組轉(zhuǎn)染效率最高，高于A6組和A8組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），A2組高于A3組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），A7組高于A9組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），其他組別相比差異不顯著（P＞0.05）（表1）。lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑中B2組轉(zhuǎn)染效率最高，高于B3組和B5組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），B1組高于B4組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05）（表2）。

表1 不同劑量pEGFP和lipofectamineLTX轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞后48 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（%）

表2 不同劑量pEGFP和lipofectamine3000轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞后48 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（%）

綜上可知lipofectamine LTX在質(zhì)粒1.0 ug，lipofectamine LTX 2 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高lipofectamine 3000在質(zhì)粒0.75 μg，lipofectamine3000 0.75 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。

2.2lipofectamine 3000與Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率

圖1和圖2分別是lipofectamine 3000和lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染后的照片，圖1的轉(zhuǎn)染效率高于圖2的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑比lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率高且差異顯著（P＜0.05）（表3）。

圖1 （40×）lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染間質(zhì)細(xì)胞

圖2 （40×）lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染間質(zhì)細(xì)胞

3　討論

本研究是應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法比較轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，ipofectamine3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒0.75 μg和轉(zhuǎn)染試劑0.75 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。但當(dāng)DNA加入過(guò)量時(shí)，轉(zhuǎn)染效率反而下降，結(jié)果與文章報(bào)道一致。這可能是因?yàn)檫^(guò)量的質(zhì)粒DNA可以形成一個(gè)類聚集體會(huì)產(chǎn)生額外的阻力，從而影響轉(zhuǎn)染水平，也可能是過(guò)量DNA會(huì)降低與帶負(fù)電荷的物質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)交換從LPP中解離出來(lái)的效率。

轉(zhuǎn)染間質(zhì)細(xì)胞時(shí)lipofectamine3000試劑在操作過(guò)程中不需要必須使用無(wú)血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中可以含有血清、雙抗等，在轉(zhuǎn)染6 h后無(wú)需再次換液直到48 h于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，因此操作較其他轉(zhuǎn)染試劑方便快捷，并且在轉(zhuǎn)染效率方面要高于lipofectamine LTX。雙抗對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)非常關(guān)鍵，有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，降低細(xì)胞污染概率。對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑的使用量增加轉(zhuǎn)染效率反而降低的原因是由于轉(zhuǎn)染試劑本身具有毒性，伴隨轉(zhuǎn)染試劑試劑量增加毒性也會(huì)增加。本試驗(yàn)中l(wèi)ipofectamine 3000的試劑和質(zhì)粒使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他轉(zhuǎn)染試劑的使用量，可減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)于細(xì)胞的毒性作用。lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)會(huì)良好，傳代后細(xì)胞死亡少，細(xì)胞狀態(tài)良好。蔣靜思等研究表明，lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率明顯高于lipofectamine 2000，本實(shí)驗(yàn)中l(wèi)ipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率且差異性顯著。因此，在使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法中l(wèi)ipofectamine 3000是更加適合轉(zhuǎn)染大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的試劑。

陳強(qiáng)（1990-），男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。

朱琳（1994-），女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。

王水蓮，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授。