何曉翔+雷永良+王曉光+傅圣勇++劉敏

[摘要] 目的 建立可同時檢測四種瘧原蟲的多重?zé)晒舛縋CR方法。 方法 PCR擴增四種瘧原蟲目的片段，克隆并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，進(jìn)行梯度稀釋。體系按濃度加入五重引物探針，對臨床四種瘧原蟲陽性血樣及單一腺病毒和肺炎支原體陽性血樣、人基因組進(jìn)行特異性檢測。將本地區(qū)優(yōu)勢蟲種惡性瘧及間日瘧陽性血樣混合并檢測。每個反應(yīng)做一式三份驗證重復(fù)性。檢測標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度，獲得體系最低檢測限。 結(jié)果 成功構(gòu)建四種瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。對20份樣本進(jìn)行檢測，其中15份惡性瘧，3份間日瘧，1份三日瘧，1份卵形瘧，與原有確證結(jié)果一致。對單一腺病毒及肺炎支原體陽性血樣、人基因組檢測結(jié)果均為陰性。惡性瘧及間日瘧陽性血樣混合檢測顯示3條特異性擴增曲線。三個復(fù)孔的變異系數(shù)在0.17～4.96之間。惡性瘧可檢測到102 copies/mL，間日瘧、三日瘧、卵形瘧可檢測到103 copies/mL。 結(jié)論 建立五重?zé)晒舛縋CR檢測四種瘧原蟲特異性及重復(fù)性均較好，靈敏度高，可用于瘧原蟲快速篩選及分型鑒定。

[關(guān)鍵詞] 多重?zé)晒舛縋CR；瘧原蟲；蚊傳染病；瘧疾

[中圖分類號] R440 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）23-0004-03

[Abstract] Objective To establish the multiple fluorescence quantitative PCR measure to detect four types of plasmodium at the same time. Methods Target fragments of four types of plasmodium were extended by PCR， the standard plasmid was cloned， constructed and diluted by gradient. Five primers and probes were added into the system according to the concentration and the clinical four plasmodium positive blood sample， single adenovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample as well as human gene was detected specifically. The falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample caused by the local superior plasmodium were mixed and detected. Each experiment was performed for three times to validate the repetitiveness. The gradient concentration of the sample was detected and the lowest detection limitation was achieved. Results The standard plasmids of four plasmodiums were successfully constructed and 20 samples were detected. 15 samples were falciparum malaria and 3 samples were tertian malaria， 1 sample was quartan malaria and 1 sample was ovale malaria， which was in accordance with the original validated results. The results of detection of single adnovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample and human gene were negative. 3 specifically extended curves were presented by the mixed detection of falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample. The variable coefficients of the three duplication holes were within 0.17-4.96. Falciparum malaria was detected to be 102 copies/mL and tertian malaria， quartan malaria as well as ovale malaria was detected to be 103 copies/mL. Conclusion The established five fluorescence quantitative-PCR in the detection of four types of plasmodium has good specificity and repetitiveness as well as high sensitivity， which can be used in the quick screening and type identification of plasmodium.

[Key words] Multiple fluorescence quantitative-PCR； Plasmodium； Mosquito-borne diseases； Malaria

瘧疾是由蚊子傳播的一種寄生蟲病，由帶有瘧原蟲的雌性按蚊叮咬人體而傳染，其已經(jīng)成為全球熱帶、亞熱帶最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。瘧疾主要有四種致病瘧原蟲：惡性瘧（falciparum）、間日瘧（vivax）、卵形瘧（ovale）、三日瘧（malariae）。隨著我國對外開放程度的不斷擴大，從瘧疾流行區(qū)歸來后引起瘧疾爆發(fā)的報道次數(shù)逐漸增多，且近年來輸入性病例所占比例不斷增加[2]，各個省份均有報道，故對瘧疾的控制計劃是巨大的挑戰(zhàn)。

臨床瘧疾診斷和最常規(guī)的方法以鏡檢瘧原蟲、臨床體征觀察、抗原檢測為主。但其準(zhǔn)確性、靈敏度均有待提高。PCR檢測外周血寄生蟲的敏感性和特異性較好，且PCR方法在分型鑒定中有特殊優(yōu)勢。目前，PCR鑒定瘧原蟲方法大致有：巢氏PCR[3，4]、一步法單管多重PCR[5]、熒光PCR（SYBR Green）[6]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增PCR（LAMP）。其中巢氏PCR擴增樣本之后需要核酸膠鑒定[7]，溶解曲線判斷要求不同種瘧原蟲的溶解溫度差異要大。本研究旨在開發(fā)操作更簡單、單步驟的多重PCR體系，在單管中能同時鑒定幾種瘧原蟲的方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

四種瘧原蟲陽性血樣來自臨床患者，病例收集時間為2014年3月1日～2016年3月1日，由本地疾控中心經(jīng)金標(biāo)、鏡檢、核酸檢測等方式確診[8]；腺病毒、肺炎支原體臨床陽性血樣，人基因組DNA由本實驗室保存。7500熒光定量PCR儀購自ABI公司，QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國qiagen）購自杭州怡丹生物技術(shù)有限公司，NanoDrop分光光度計購自賽默飛世爾科技。Premix Ex Taq、T載體購自takara。割膠回收試劑盒購自Promega公司。Taq酶購自全式金公司。TG1菌株由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 四種瘧原蟲陽性血樣提核酸DNA，使用通用上下游引物（表1），Taq酶PCR擴增見試劑說明書，溫度：94℃ 2 min。94°C 30 s，61°C 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)，72°C 10 min。使用試劑盒純化PCR產(chǎn)物，克隆到pMD19-T載體。轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，在藍(lán)白斑上挑取白斑。提質(zhì)粒DNA[9]，測序驗證，使用分光光度計測定濃度并按公式計算拷貝數(shù)[10]，進(jìn)行梯度倍比稀釋。

1.2.2 特異性及重復(fù)性檢測 ①對四種瘧原蟲陽性血樣共20份樣本進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR檢測，體系引物探針用量見表1。25 μL總體積，10 μL混合液，模板4 μL。95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40個循環(huán)；60℃搜集熒光信號。質(zhì)量控制：加入腺病毒、肺炎支原體陽性血樣DNA，人基因組DNA。②將惡性瘧與間日瘧陽性血樣混合在一管中，使用自建體系檢測，比較特異性。對同一反應(yīng)做三個復(fù)孔，計算均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，比較重復(fù)性。

1.2.3 靈敏度檢測 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度梯度為10、102、103、104、105、106、107 copies/mL，檢測最低檢測限[11]。

2結(jié)果

2.1特異性

PCR結(jié)果顯示40條特異擴增的S型曲線，通用FAM熒光標(biāo)記20條典型S型曲線，15份樣本HEX熒光基團(tuán)標(biāo)記為惡性瘧，3份CY5標(biāo)記為間日瘧，1份ROX三日瘧，1份CY3卵形瘧，腺病毒及肺炎支原體陽性血樣、人基因組樣本檢測均未見特異性擴增。以上所有樣本均與預(yù)期結(jié)果符合?；旌涎獦訕颖緳z測顯示FAM、HEX、CY5

2.2重復(fù)性

2.3 靈敏度

經(jīng)測序，成功構(gòu)建四種瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，四個標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均>0.993，各稀釋度曲線相關(guān)性好，惡性瘧的為最低檢測限為102 copies/mL，間日瘧、三日瘧、卵形瘧均為103 copies/mL。

3討論

多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)由實時熒光PCR發(fā)展而來，通過幾種不同的探針熒光報告基團(tuán)混合，能同時檢測基因序列不同的病原體，在國內(nèi)外蓬勃發(fā)展[12-14]。傳統(tǒng)PCR技術(shù)檢測瘧原蟲需要經(jīng)過多輪擴增或使用多對引物同時擴增才能鑒別，凝膠電泳費時且難以自動化。本實驗旨在單管一步反應(yīng)獲得直觀結(jié)果，簡化實驗步驟。

我國瘧疾消除計劃初顯成效，近年來病例多為輸入性感染，大量用藥導(dǎo)致耐藥發(fā)生，檢測瘧原蟲隱蔽性及困難程度增加。鏡檢診斷瘧原蟲對技術(shù)人員專業(yè)要求高，且容易漏診。部分地區(qū)實驗室鏡檢技術(shù)力量薄弱，一線醫(yī)技人員對疫情不能及時檢驗[15]，PCR快速檢測在出入境關(guān)口能克服顯微鏡的限制，陽性檢出率高[16，17]，且不受耐藥寄生蟲影響，應(yīng)用廣泛[18]。我市患者多為惡性瘧或間日瘧感染，快速準(zhǔn)確鑒別蟲種對合理治療有重大意義。

目前國外學(xué)者Phuong M等[19]針對地區(qū)優(yōu)勢瘧原蟲種類設(shè)計兩、三重?zé)晒馓结?，不能同時鑒定四種瘧原蟲。國內(nèi)學(xué)者黃雨婷[7]、李美等[20]檢測四種瘧原蟲，巢氏引物擴增后經(jīng)核酸膠鑒定蟲種，曲線的Tm值集中，不易區(qū)分和鑒別蟲種。

本實驗通過對以上方法的綜合和優(yōu)化，調(diào)整反應(yīng)條件、濃度、熒光探針，建立單管中能同時檢測四種瘧原蟲的多重PCR探針系統(tǒng)。本實驗方法操作簡單，從提取DNA到讀出結(jié)果在3 h內(nèi)完成，該系統(tǒng)可對除wallikeri亞種之外的瘧原蟲進(jìn)行分型，但瘧原蟲屬保守18S小亞基核糖體基因設(shè)計的通用上下游引物可檢測出所有瘧原蟲病原體，以此可應(yīng)對瘧原蟲多個基因型差異[21]。本研究的20份樣本均已確診，使用自建方法得出預(yù)期結(jié)果，通過反應(yīng)可區(qū)分出四種瘧原蟲?；旌涎獦又屑尤肴嘶蚪M，可測得通用、惡性、間日瘧特異性擴增，應(yīng)對混合感染[22]。三個復(fù)孔檢測曲線呈高度相關(guān)性，變異系數(shù)<5。對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋的梯度濃度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示較好的相關(guān)性。四種瘧原蟲最低檢測限均<103 copies/mL，惡性瘧可達(dá)102 copies/mL，該靈敏度優(yōu)于其他方法，且有利于混合感染的檢測，進(jìn)一步滿足日常檢測工作需要。在靈敏度與重復(fù)性檢測中，梯度濃度相關(guān)曲線系數(shù)R2>0.98，表明標(biāo)準(zhǔn)品定量可靠。PCR操作過程中需注意污染，且由于本體系引物探針眾多，需保證序列質(zhì)量及保存恰當(dāng)。為了最大限度獲得特異性擴增，本實驗優(yōu)化反應(yīng)條件及體系濃度，增加特異性及敏感性。上述檢測結(jié)果顯示自建方法高靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，適合在出入境、檢驗檢疫等部門推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lee PC，Chong E T，Anderios F，et al. Molecular detection of human Plasmodium species in Sabah using PlasmoNex multiplex PCR and hydrolysis probes real-time PCR[J]. Malar J，2015，14（11）： 28-35.

[2] 王亞麗，王煊，張彥平. 2005～2013年全國本地感染與境外輸入瘧疾流行病學(xué)特征分析[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2015，11（2）：120-126.

[3] 孫菲，萬向陽，李歡，等. 多重巢式PCR檢測惡性瘧和間日瘧原蟲[J]. 臨床檢驗雜志，2014，32（8）：565-567.

[4] 王真瑜，張耀光，江莉，等. 上海市1例輸血性三日瘧病例的實驗室檢測分析與診斷[J]. 中國血吸蟲病防治雜志，2015，17（4）：362-366.

[5] 李歡，孫菲，文嵐，等. 多重PCR快速檢測惡性瘧和間日瘧的研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2014，23（3）：288-291.

[6] 李歡. SYBR Green實時PCR檢測惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲方法的建立[D]. 中南大學(xué)，2014.

[7] 黃雨婷，佘丹婭，盧麗丹，等. 單管單輪多重PCR檢測4種瘧原蟲混合血樣[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2015，33（3）：200-205.

[8] 雷永良，陳秀英，葉夏良，等. 經(jīng)輸血傳播的1例惡性瘧報告[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，15（2）：170-171.

[9] Sheikh IH，Kaushal DC，Chandra D，et al. Immunogenicity of a plasmid DNA vaccine encoding 42kDa fragment of Plasmodium vivax merozoite surface protein-1[J]. Acta Trop，2016，162（13）： 66-74.

[10] 戴玉柱，崔大偉，楊先知，等. 五重?zé)晒舛縍T-PCR法檢測甲型流感病毒[J]. 臨床檢驗雜志，2015，33（9）：641-644.

[11] Gupta H，Srivastava S，Chaudhari S，et al. New molecular detection methods of malaria parasites with multiple genes from genomes[J]. Acta Trop，2016，160（14）：15-22.

[12] 趙冉，陳瓊，孔繁德，等. 4種腸道致病菌的多重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法的建立[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2014，3（8）：67-71.

[13] 程鵬飛，唐景峰，程弘夏，等. 淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、細(xì)小脲原體多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2014，6（1）：109-119.

[14] 王原，崔大偉，胡正軍，等. 一步法多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測人杯狀病毒的建立及應(yīng)用[J]. 臨床檢驗雜志，2014，32（9）：647-651.

[15] 王勝啟，李靜，郭玉琪，等. 新形勢下輸入性瘧疾疫情防控研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（4）：132-135.

[16] 張憲華. 腸道病毒71型（EV71）的檢測[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，53（20）：93-95.

[17] 紀(jì)衍瑾，孫雯雯，祝喆，等. 應(yīng)用實時熒光RT-PCR法檢測水產(chǎn)品中諾如病毒[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，53（19）：130-132.

[18] 萬向陽，孫菲，李歡. 熒光定量PCR技術(shù)在瘧疾診斷中的應(yīng)用[J]. 實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，34（1）：127-129.

[19] Phuong M，Lau R，Ralevski F，et al. Sequence-based optimization of a quantitative real-time PCR assay for detection of Plasmodium ovale and Plasmodium malariae[J]. J Clin Microbiol，2014，52（4）：1068-1073.

[20] 李美，夏志貴，湯林華. 檢測4種人體瘧原蟲多重PCR體系的建立和應(yīng)用[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2015，33（2）：91-95.

[21] Mahdi AHM，Elamin AF，Albsheer MM，et al. Multiplicity of infection and genetic diversity of Plasmodium falciparum isolates from patients with uncomplicated and severe malaria in Gezira State，Sudan[J]. Parasit Vectors，2016，9（1）：362-370.

[22] Nabet C，Doumbo S，Jeddi F，et al. Genetic diversity of Plasmodium falciparum in human malaria cases in Mali[J].Malar J，2016，15（18）：353-361.

（收稿日期：2016-04-19）