鮑偉光　郝　月　崔艷軍　李潔蕾　張校軍　李　淦　王占彬　顧憲紅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽471003)

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敵草快和硫辛酸對育肥豬腸道結(jié)構(gòu)及消化功能的影響

鮑偉光1郝月1崔艷軍1李潔蕾1張校軍1李淦1王占彬2顧憲紅1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽471003)

本文旨在研究敵草快和硫辛酸(LA)對育肥豬腸道結(jié)構(gòu)及消化功能的影響，以探究LA對敵草快引起的應(yīng)激是否有緩解作用。選取24頭(70.64±3.61) kg的健康大白閹公豬，按照2×2因子設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為對照組、LA組、敵草快組和LA+敵草快組，每個(gè)組設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期29 d。LA添加劑量為800 mg/kg飼糧，飼喂貫穿試驗(yàn)全程，而一次性腹腔滴注敵草快于試驗(yàn)第15天進(jìn)行，無腹腔滴注敵草快試驗(yàn)豬滴注等量的生理鹽水。于試驗(yàn)第29天對所有試驗(yàn)豬前腔靜脈采血后屠宰取樣，運(yùn)用試劑盒檢測血漿和腸道氧化損傷標(biāo)志物的含量以及空腸食糜消化酶的活性，蘇木精-伊紅(HE)染色后運(yùn)用圖像分析軟件觀察腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)并測定絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)，熒光定量PCR法檢測閉合蛋白(occludin)和緊密結(jié)合蛋白(ZO-1)的相對表達(dá)量。結(jié)果表明：1)敵草快極顯著升高了試驗(yàn)豬血漿和腸道丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基(PCO)和8-羥基鳥苷(8-OHdG)的含量(P<0.01)，極顯著降低了十二指腸、空腸及回腸絨毛高度、隱窩深度(P<0.01)，極顯著增大了十二指腸和空腸V/C(P<0.01)，顯著增大了回腸V/C(P<0.05)，極顯著降低了空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量(P<0.01)，極顯著降低了空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶的活性(P<0.01)。2)飼糧中添加LA對試驗(yàn)豬血漿和腸道MDA、PCO和8-OHdG含量的影響均不顯著(P>0.05)，對十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度以及V/C的影響均不顯著(P>0.05)，對空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量的影響也不顯著(P>0.05)，對空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶活性的影響差異也均不顯著(P>0.05)。3)在應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加LA使豬血漿8-OHdG含量顯著降低(P<0.05)，十二指腸絨毛高度、空腸絨毛高度以及回腸隱窩深度顯著升高(P<0.05)，空腸V/C顯著降低(P<0.05)，回腸V/C極顯著降低(P<0.01)，空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，空腸食糜淀粉酶和胰蛋白酶的活性顯著提升(P<0.05)。由此可見，敵草快引起了育肥豬強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致了腸道結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重?fù)p傷并減弱了腸道的消化功能；在敵草快引起的應(yīng)激狀態(tài)下，飼糧中添加800 mg/kg LA能夠減緩腸道結(jié)構(gòu)的損傷并能一定程度地提高腸道的消化功能。

敵草快；硫辛酸；育肥豬；氧化應(yīng)激；腸道

生物體內(nèi)的能量代謝將氧氣作為有氧代謝過程中的電子接受體，不可避免地產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)，過量的ROS產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷及炎癥反應(yīng)可通過多種途徑導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)和疾病[1-2]。在氧化應(yīng)激條件下，腸黏膜的特殊結(jié)構(gòu)及氧的對流交換機(jī)制決定了它更容易造成氧化損傷，經(jīng)常出現(xiàn)腸道蠕動(dòng)異常、黏膜滲透性增高、電解質(zhì)分泌、腸上皮形態(tài)及細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和消化功能異常等癥狀[3]。因此，研究氧化應(yīng)激對腸道的損傷及消化功能的影響變得尤為重要。敵草快(diquat)為氧化還原型雙吡啶除草劑，屬中等毒性化合物，敵草快進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，利用分子氧產(chǎn)生氧自由基和其他ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。硫辛酸(lipoic acid,LA)作為一種高效的抗氧化劑可以減少ROS的產(chǎn)生，減弱DNA的氧化損傷，抑制脂質(zhì)過氧化，并能很大程度地改善體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，對氧化應(yīng)激引起的疾病有顯著的緩解作用[4-5]。Guven等[6]報(bào)道，LA可以通過清除ROS和RNS對大鼠小腸缺血性再灌注損傷進(jìn)行修復(fù)。Powell等[7]報(bào)道，小腸細(xì)胞系DLD-1高糖損傷組的谷胱甘肽(GSH)含量與對照組相比顯著降低，添加LA后細(xì)胞中GSH含量恢復(fù)正常；同時(shí)發(fā)現(xiàn)高糖損傷組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)啟動(dòng)子基因表達(dá)上調(diào)，而LA損傷修復(fù)組顯著降低了iNOS啟動(dòng)子表達(dá)上調(diào)量，在轉(zhuǎn)錄水平證明了LA對小腸細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用。Cui等[8]進(jìn)一步從腸道免疫細(xì)胞受體基因表達(dá)量驗(yàn)證LA的抗氧化作用，高脂飼糧能引起慢性氧化損傷，抑制腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致了對黏膜免疫力的抑制，而LA能夠通過從轉(zhuǎn)錄水平修復(fù)相關(guān)基因、腸道氧化損傷和免疫抑制反應(yīng)。近年的研究顯示，LA有非常強(qiáng)的抗氧化效果，而且現(xiàn)有研究未發(fā)現(xiàn)任何副作用。然而，LA的研究多選用小型動(dòng)物建立氧化應(yīng)激模型，且有關(guān)LA緩解氧化應(yīng)激的研究大多都限制在細(xì)胞水平，對建立大中型動(dòng)物模型研究LA調(diào)控腸道氧化應(yīng)激的試驗(yàn)相對較少。本課題組以育肥豬為研究對象，選用敵草快誘導(dǎo)試驗(yàn)豬產(chǎn)生氧化應(yīng)激，探討氧化應(yīng)激對試驗(yàn)豬腸道氧化損傷標(biāo)志物、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、上皮細(xì)胞緊密結(jié)合性以及消化酶活性的影響，選擇LA為營養(yǎng)素，探究飼糧中添加LA對氧化應(yīng)激育肥豬腸道損傷及消化功能的調(diào)控作用，為進(jìn)一步揭示其緩解大中型動(dòng)物氧化應(yīng)激的作用機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計(jì)，腹腔是否滴注敵草快(0、8 mg/kg體重)和飼糧中是否添加LA(0、800 mg/kg飼糧)為2個(gè)主效應(yīng)，共形成4個(gè)組(對照組、LA組、敵草快組和LA+敵草快組)。敵草快購自美國Sigma公司；LA購自美國Amresco公司，純度≥99%。

選取24頭體重(70.64±3.61) kg的健康大白閹公豬，根據(jù)體重相近的原則隨機(jī)分為4個(gè)組，每個(gè)組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期為29 d。其中LA從試驗(yàn)第1天就開始添加，直到全程；腹腔滴注敵草快于試驗(yàn)第15天進(jìn)行，每頭試驗(yàn)豬一次性滴注量為8 mg/kg體重，以250 mL生理鹽水稀釋后采用輸液器滴注，其他試驗(yàn)豬滴注等量的生理鹽水，滴注耗時(shí)約5 min。

1.2試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)飼糧為粉料，基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NRC(2012)及中國《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 65—2004 )相應(yīng)階段營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。為保證飼糧質(zhì)量，根據(jù)試驗(yàn)豬日采食量估算每周采食總量，并根據(jù)配方每周配料1次，配料時(shí)按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)向基礎(chǔ)飼糧中分別添加0、800 mg/kg LA構(gòu)成2種試驗(yàn)飼糧。

試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)基地豬場進(jìn)行。試驗(yàn)前，圈舍進(jìn)行徹底清洗打掃，以2%～3%濃度的燒堿和百毒殺先后進(jìn)行2次消毒，再熏蒸消毒(髙猛酸鉀∶甲醛=1∶2，室內(nèi)密閉)24 h，通風(fēng)干燥5 d，轉(zhuǎn)入試驗(yàn)豬當(dāng)天再用百毒殺消毒。轉(zhuǎn)入的試驗(yàn)豬飼養(yǎng)在160 cm×90 cm×120 cm的代謝籠中，單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)約1周后開始正式試驗(yàn)，試驗(yàn)期間由專人對試驗(yàn)豬進(jìn)行管理和飼喂，所有操作均嚴(yán)格按照飼養(yǎng)手冊進(jìn)行，盡可能減少與試驗(yàn)無關(guān)的應(yīng)激因素，環(huán)境溫度控制在15～20 ℃，相對濕度40%～60%。

1.3樣品采集

試驗(yàn)的第29天前腔靜脈采血，離心后取上清液分裝至1.5 mL離心管，-20 ℃保存。用電擊棒(110 V、5 A)將豬只擊暈、懸掛、頸動(dòng)脈放血，整個(gè)過程在半分鐘內(nèi)完成以確保將試驗(yàn)豬的痛苦降到最低。待豬只沒有角膜反射后，立即沿腹中線剖開，取出內(nèi)臟。找到空腸中段部位剪取1～2 cm空腸段，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉食糜后，放入離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存。取距幽門口5～10 cm處的十二指腸；整個(gè)空腸組織中段部位的空腸；距離回盲連接處5～10 cm的回腸；各取1 cm的十二指腸、空腸、回腸腸段用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉食糜后，放入10%的福爾馬林溶液中固定。接取空腸食糜，放入離心管中，液氮速凍，-20 ℃保存。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet：VA 2 512 IU，VD31 200 IU，VE 4 IU，VK31.5 mg，VB1217.6 μg，核黃素 riboflavin 2.5 mg，泛酸 pantothenic acid 6.8 mg，煙酸 niacin 20.3 mg，膽堿 choline 351 mg，Mn 10 mg，F(xiàn)e 50 mg，Zn 50 mg，Cu 10 mg，I 0.3 mg，Se 0.3 mg。

2)消化能為計(jì)算值，其余營養(yǎng)水平為實(shí)測值。DE was a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.

1.4檢測指標(biāo)和測定方法

1.4.1血漿生化指標(biāo)的測定

用含肝素鈉抗凝劑的采血管采集前腔靜脈血液，靜置10～15 min后，在離心機(jī)中以3 000 r/min離心10 min分離血漿，-20 ℃保存。血漿中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PCO)含量都采用比色法測定，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測豬血漿8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy deoxyguanosine,8-OHdG)的含量，試劑盒購自R&D公司。

1.4.2空腸組織生化指標(biāo)的測定

將腸道組織樣品從-80 ℃冰箱取出放入研缽，邊倒入液氮邊研磨，直至磨成粉末，準(zhǔn)確稱量粉末重量，并按照1∶9加入生理鹽水制成10%的組織勻漿；在4 ℃的低溫冷凍離心機(jī)中以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清后原液備用；將原液用生理鹽水稀釋至1%的組織勻漿，用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定1%組織勻漿中的蛋白質(zhì)濃度，再用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定組織中MDA和PCO的含量。使用ELISA方法檢測豬腸段8-OHdG的含量，試劑盒購自R&D公司。

1.4.3空腸食糜消化酶活性的測定

將采集的空腸食糜在4 ℃冰箱中解凍后，用4 ℃的低溫冷凍離心機(jī)以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)用于測定。食糜中的淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.4.4腸道組織切片

從固定液中取出腸道組織，經(jīng)一系列由低到高濃度的乙醇脫水，二甲苯透明后，55 ℃于銅質(zhì)模具進(jìn)行石蠟包埋，用切片機(jī)切成5 μm厚度的切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。每個(gè)樣品做3張不連續(xù)性切片進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品各選取6個(gè)完整、典型的絨毛視野，采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)采集圖像并測定絨毛高度(絨毛頂端至隱窩開口處的垂直距離)、隱窩深度(隱窩開口至隱窩基底部的垂直距離)，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)的值。

1.4.5空腸閉合蛋白(occludin)和緊密結(jié)合蛋白(zonula occludens protein-1,ZO-1)轉(zhuǎn)錄水平的相對表達(dá)量

將空腸組織樣品從-80 ℃冰箱取出放入研缽，邊倒入液氮邊研磨，直至磨成粉末，取少量粉末于1.5 mL離心管中，使用ThermoSCRIPTTM熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒，參照其說明書進(jìn)行總RNA提取和mRNA反轉(zhuǎn)錄，然后使用熒光實(shí)時(shí)定量檢測方法對occludin和ZO-1的相對表達(dá)量進(jìn)行定時(shí)定量分析。雙鏈DNA染色使用嵌合熒光染色法染色。根據(jù)豬3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease gene,GAPDH)、occludin和ZO-1的基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并用NCBI中Blast初步檢測引物的特異性。引物序列如表2所示。

表2　目的基因引物序列

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素有互作的方差分析，并在氧化應(yīng)激的情況下對是否添加LA的2組進(jìn)行t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2　結(jié)　果

2.1敵草快和LA對育肥豬腸道氧化損傷及屏障功能的影響

2.1.1敵草快和LA對育肥豬血漿和腸道氧化損傷產(chǎn)物的影響

由表3可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬血漿和腸道MDA、PCO和8-OHdG含量極顯著升高(P<0.01)；飼糧中添加LA對育肥豬血漿和腸道MDA、PCO和8-OHdG含量均無顯著影響(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對育肥豬血漿PCO含量有顯著的交互作用(P<0.05)，對血漿8-OHdG含量的交互作用接近顯著(P=0.09)，對血漿和腸道MDA、腸道PCO以及腸道8-OHdG含量的交互作用均不顯著(P>0.05)。對應(yīng)地，在非應(yīng)激的情況下飼糧中添加LA對育肥豬血漿8-OHdG的含量并無顯著影響(P>0.05)，然而在氧化應(yīng)激的情況下，飼糧中添加LA使育肥豬血漿8-OHdG的含量顯著降低(P<0.05)。

2.1.2敵草快和LA對育肥豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

從圖1可以看出,對照組和LA組試驗(yàn)豬腸結(jié)構(gòu)完整，無明顯的損傷出現(xiàn)；滴注敵草快的所有試驗(yàn)豬腸絨毛出現(xiàn)斷裂、腫脹的現(xiàn)象，腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)受損；然而，腹腔滴注敵草快相比沒有腹腔滴注敵草快的試驗(yàn)豬，飼糧中添加LA一定程度地減弱了試驗(yàn)豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)受損的程度。

由表4可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬十二指腸、空腸及回腸絨毛高度、隱窩深度極顯著降低(P<0.01)，十二指腸和空腸V/C極顯著增大(P<0.01)，回腸V/C顯著增大(P<0.05)；飼糧中添加LA對育肥豬腸道絨毛高度、隱窩深度以及V/C均無顯著影響(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對回腸V/C有極顯著的交互作用(P<0.01)，對十二指腸絨毛高度(P=0.07)、空腸絨毛高度(P=0.07)和V/C(P=0.11)以及回腸隱窩深度(P=0.09)交互作用接近顯著，對十二指腸隱窩深度和V/C、空腸隱窩深度以及回腸絨毛高度的交互作用均不顯著(P>0.05)。對應(yīng)地，腹腔滴注敵草快相比沒有腹腔滴注敵草快的育肥豬，飼糧中添加LA對腸道的影響更為明顯；表現(xiàn)為十二指腸絨毛高度、空腸絨毛高度以及回腸隱窩深度顯著升高(P<0.05)，空腸V/C顯著降低(P<0.05)，回腸V/C極顯著降低(P<0.01)。

表3　敵草快和LA對育肥豬血漿和腸道氧化損傷產(chǎn)物的影響

Diquat：敵草快；LA：硫辛酸；D×LA：敵草快×硫辛酸；+表示添加或滴注，-表示未添加或未滴注。同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Diquat: diquat; LA: lipoic acid; D×LA: diquat ×lipoic acid; + mean added or injection; - mean without added or no injection. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.1.3敵草快和LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量的影響

由圖2可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；飼糧中添加LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量的影響均不顯著(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量交互作用影響均不顯著(P>0.05)。然而，在非應(yīng)激的情況下LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量的影響不顯著(P>0.05)；在氧化應(yīng)激的情況下，飼糧中添加LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量均顯著地提升(P<0.05)。

2.2敵草快和LA對育肥豬空腸食糜中消化酶活性的影響

由表5可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶的活性極顯著降低(P<0.01)；飼糧中添加LA對育肥豬空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶活性的影響不顯著(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對空腸食糜中淀粉酶和胰蛋白酶活性的交互作用接近顯著(P=0.09)，對空腸食糜中脂肪酶活性的交互作用不顯著(P>0.05)。對應(yīng)地，在非應(yīng)激的情況下LA對育肥豬空腸糜中淀粉酶和胰蛋白酶的影響均不顯著(P>0.05)，然而在氧化應(yīng)激的情況下，飼糧中添加LA對育肥豬空腸食糜中淀粉酶以及胰蛋白酶的活性均有顯著地提升(P<0.05)。

3　討　論

LA屬于維生素B族物質(zhì)，同時(shí)也是一些微生物的內(nèi)源性生長因子。外源性LA具有抗氧化以及抗炎癥作用。敵草快為氧化還原型雙吡啶除草劑，屬中等毒性化合物。敵草快進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，利用分子氧產(chǎn)生氧自由基和其他ROS[9]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，作為一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑分別應(yīng)用于野生型大鼠[10]、斷奶仔豬[11]和生長豬[12]，并成功建立了氧化應(yīng)激模型。本試驗(yàn)中腹腔滴注8 mg/kg體重?cái)巢菘煲罁?jù)李麗娟等[11]使用12 mg/kg體重?cái)巢菘煺T導(dǎo)了斷奶仔豬產(chǎn)生氧化應(yīng)激，徐靜等[12]按8 mg/kg體重劑量一次性腹腔注射敵草快溶液，可誘導(dǎo)生長豬氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激效應(yīng)可持續(xù)28 d，血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量可作為反映氧化應(yīng)激的敏感指標(biāo)。本試驗(yàn)腹腔滴注8 mg/kg體重?cái)巢菘焖性囼?yàn)豬均出現(xiàn)急躁、空口咀嚼、嘔吐、厭食等現(xiàn)象，持續(xù)1周左右后，采食量逐漸恢復(fù)，非應(yīng)激組滴注等量的生理鹽水未見豬只行為異常，這與前人的研究結(jié)果[11-15]類似，而本研究選擇育肥豬作為試驗(yàn)動(dòng)物為建立大中型氧化應(yīng)激動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。雖然LA作為緩解敵草快導(dǎo)致的氧化應(yīng)激未見報(bào)道，但是有研究表明LA可以用于治療百草枯(paraquat)引起的中毒[16]，而百草枯作為一種有機(jī)雜環(huán)類接觸性除草劑與敵草快結(jié)構(gòu)功能相似。

圖1　敵草快和LA對育肥豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3.1敵草快和LA對育肥豬腸道氧化損傷及屏障功能的影響

腸道極易受氧化的損傷[17]，腹腔滴注的敵草快進(jìn)入機(jī)體首先通過的是腸黏膜，腸黏膜氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的過多的氧自由基如ROS和RNS可以破壞DNA、生物脂質(zhì)大分子、蛋白質(zhì)和其他生物大分子，過多的氧自由基可以通過抗氧化系統(tǒng)消除，包括非酶成分和抗氧化酶系[18-19]。LA的特殊結(jié)構(gòu)決定了它具有清除機(jī)體過量的自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、減弱DNA的氧化損傷等功能[20]。因此，飼糧中添加LA能很大程度地改善體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)。

宋小珍等[21]在斷奶仔豬上的研究表明，氧化應(yīng)激使豬腸道SOD、GSH-Px的活性顯著降低，而MDA的含量顯著上升。Chen等[22]研究表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致仔豬小腸功能障礙并顯著降低了SOD等抗氧化物酶的活性。王遠(yuǎn)孝等[23]的研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激降低了空腸黏膜總抗氧化能力、谷胱甘肽還原酶和GSH-Px活性，提高了MDA含量。Kataria等[24]的研究也證明了氧化應(yīng)激對豬抗氧化物酶有抑制作用。以上試驗(yàn)表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致了抗氧化酶活性的降低。本試驗(yàn)則通過檢測氧化損傷標(biāo)志物來說明腸道是否遭受了氧化損傷，結(jié)果表明，所有氧化應(yīng)激的試驗(yàn)豬血漿和腸道MDA、PCO以及8-OHdG含量均極顯著升高，說明氧化應(yīng)激造成了試驗(yàn)豬脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的嚴(yán)重?fù)p傷。張海超[25]的研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激造成了腸道的氧化損傷，顯著降低了血漿MDA和空腸PCO的含量。張焱等[26]的研究結(jié)果顯示，過高的氧化應(yīng)激水平參與胃腸道腫瘤的發(fā)生，造成MDA和8-OHdG含量明顯升高。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果類似。LA緩解氧化應(yīng)激分別于小鼠[27-28]、肉雞[29]、奶牛[30]以及細(xì)胞水平[31]有了一定的研究，然而對于育肥豬的研究還尚屬空缺，在本試驗(yàn)中，同在氧化應(yīng)激的情況下，攝食LA的試驗(yàn)豬相比攝食基礎(chǔ)飼糧的試驗(yàn)豬損傷程度更低，說明LA有緩解氧化應(yīng)激的能力，而飼糧中添加LA的試驗(yàn)豬血漿8-OHdG含量降低達(dá)到了顯著水平，說明LA有可能對試驗(yàn)豬DNA有一定的修復(fù)能力。

表4　敵草快和LA對育肥豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

D：敵草快；LA：硫辛酸；D×LA：敵草快×硫辛酸；+表示添加或滴注，-表示未添加或未滴注；**：P<0.01；*：P<0.05；n.s.：P>0.05。

D: diquat; LA: lipoic acid; D×LA: diquat ×lipoic acid; + mean added or injection; - mean without added or no injection; **:P<0.01; *:P<0.05; n.s.:P>0.05.

圖2　敵草快和LA對育肥豬空腸occludin(A)和ZO-1(B)mRNA相對表達(dá)量的影響

小腸結(jié)構(gòu)的正常是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和機(jī)體正常生長的生理基礎(chǔ)，腸道絨毛高度、隱窩深度、V/C等是衡量小腸結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。從組織學(xué)上講，絨毛萎縮引起的絨毛表面積的減少會(huì)造成小腸吸收功能的下降，即絨毛高度的下降會(huì)降低小腸的吸收功能[32]；隱窩深度反映的是細(xì)胞的生成率，隱窩變淺表明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)，隱窩的深淺對維持腸道結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要的意義[33]；V/C則綜合反映了小腸的功能狀態(tài)，其比值的下降表明黏膜受損，消化吸收功能下降。王蕾等[34]的研究表明，應(yīng)激導(dǎo)致豬絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增大，V/C顯著降低。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激顯著降低了腸道絨毛高度、隱窩深度，顯著增加了V/C，此結(jié)果中隱窩深度和V/C的變化正好與王蕾等[34]的結(jié)果相悖。而Xiao等[35]研究表明，氧化應(yīng)激使豬腸道絨毛高度、隱窩深度降低，使V/C增加，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。據(jù)推測，在強(qiáng)烈氧化應(yīng)激的情況下，小腸為了抵御應(yīng)激會(huì)生成大量的細(xì)胞以更新死亡的細(xì)胞，反而引起分泌功能加強(qiáng)，隱窩深度變淺；而V/C增加也可能是由于在劇烈氧化應(yīng)激狀態(tài)下隱窩深度變淺的程度強(qiáng)于絨毛高度降低的程度。本試驗(yàn)中試驗(yàn)豬所遭受的氧化應(yīng)激是劇烈的，此外，同在氧化應(yīng)激的情況下，飼糧中添加LA使十二指腸和空腸的絨毛高度顯著增加，說明LA對氧化應(yīng)激狀態(tài)下試驗(yàn)豬十二指腸和空腸絨毛有了一定的修復(fù)；然而，在強(qiáng)烈的應(yīng)激狀態(tài)下LA組回腸隱窩深度顯著高于非LA組，說明LA一定程度的減弱了氧化應(yīng)激，進(jìn)而減緩了回腸氧化應(yīng)激狀態(tài)下新生細(xì)胞的速度；由于LA的強(qiáng)氧化性使氧化應(yīng)激急速減緩，進(jìn)而使隱窩深度顯著升高，而此時(shí)氧化應(yīng)激導(dǎo)致腸道的絨毛高度斷裂還未能修復(fù)，因此空腸和回腸的V/C顯著降低。

緊密連接是構(gòu)成上皮屏障功能最重要的結(jié)構(gòu)，由occludin和ZO-1等結(jié)構(gòu)蛋白及各類連接蛋白分子共同組成。ZO-1與維持和調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和屏障功能有關(guān)，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、維持上皮極性等重要過程。occludin功能涉及細(xì)胞間黏附、移動(dòng)及通透性，一旦發(fā)生變異、減少和缺失可引起腸上皮細(xì)胞間隙通透性增加，因此occludin和ZO-1常被用來作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標(biāo)[36-39]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激極顯著降低了試驗(yàn)豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量，更深度地證明氧化應(yīng)激造成了試驗(yàn)豬腸道的損傷，而同在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，LA組的試驗(yàn)豬occludin和ZO-1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于敵草快組，說明LA在氧化應(yīng)激的情況下起到了修復(fù)試驗(yàn)豬腸道的作用，在非應(yīng)激的情況下LA并無顯著的作用。根據(jù)前文的試驗(yàn)結(jié)果我們推測LA并沒有直接修復(fù)腸道的作用，而是通過其特殊結(jié)構(gòu)清除腸道過量的自由基使得腸道免受其害，進(jìn)而達(dá)到了保護(hù)腸道的作用。

3.2敵草快和LA對育肥豬消化功能的影響

消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)是小腸的首要功能。其中空腸位于小腸中段，相比十二指腸和回腸更長，是動(dòng)物消化吸收飼料的主要場所[40]?？漳c內(nèi)食糜消化酶的活性能夠直接地反映出腸道消化吸收的能力，當(dāng)腸道損傷時(shí)，消化酶會(huì)一定程度地減少，活性也會(huì)相應(yīng)降低[41]。近幾年，國內(nèi)外研究氧化應(yīng)激對育肥豬消化功能的影響相對較少。Guo等[42]對小鼠的研究顯示，氧化應(yīng)激造成腸道的病變并顯著降低了腸道消化酶的活性。Gessner等[43]的研究表明，氧化應(yīng)激使仔豬消化酶活性顯著降低。本試驗(yàn)中，氧化應(yīng)激極顯著地降低了腸道淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶活性，進(jìn)一步印證了氧化應(yīng)激對腸道消化功能的負(fù)作用。此外，本試驗(yàn)加入的LA顯著增加了氧化應(yīng)激試驗(yàn)豬淀粉酶和胰蛋白酶的活性，說明LA可能具有提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下育肥豬的消化功能，根據(jù)本試驗(yàn)中其他試驗(yàn)結(jié)果的分析，推測LA可能是通過清除體內(nèi)的自由基來緩解氧化應(yīng)激對腸道的損傷，進(jìn)而增加了腸道絨毛高度，提高了消化能力，而具體的生理機(jī)制還需進(jìn)一步探究。然而，LA對動(dòng)物消化功能的作用未見報(bào)道，根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果可以初步推測LA可能是通過清除體內(nèi)過量的自由基緩解了應(yīng)激，維持了機(jī)體正常的氧化還原狀態(tài)，從而增加了腸道絨毛高度、減緩了黏膜受損度并提高了空腸食糜中消化酶的活性，進(jìn)而改善了育肥豬的消化功能。

4　結(jié)　論

本試驗(yàn)研究表明，腹腔滴注8 mg/kg體重?cái)巢菘鞂τ守i腸道結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重?fù)p傷并減弱了腸道的消化功能；飼糧中添加800 mg/kg LA對腸道結(jié)構(gòu)和消化功能的影響較??；然而，在敵草快引起的應(yīng)激狀態(tài)下，LA能夠減緩腸道的結(jié)構(gòu)損傷并能一定程度地提高腸道的消化功能。

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(責(zé)任編輯武海龍)

Effects of Diquat and Lipoic Acid on Intestinal Morphology and Digestive Function of Finishing Pigs

BAO Weiguang1HAO Yue1CUI Yanjun1LI Jielei1ZHANG Xiaojun1LI Gan1WANG Zhanbin2GU Xianhong1*

(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Animal Sciences,Beijing 100193, China; 2. College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

This study was to investigate the effects of diquat and lipoic acid (LA) on intestinal morphology and digestive function of finishing pigs, in order to explore whether diquat induced stress on the LA had a role in alleviating. Twenty-four healthy finishing pigs (Yorkshire) with the body weight of (70.64±3.61) kg were randomly allocated to control, LA, diquat, LA+diquat groups with 6 replicates per group and 1 pig per replicate by a 2×2 factorial arrangement. The trial period was 29 days. LA was given all in the trial (800 mg/kg diet). Diquat challenged pigs were given a single intraperitoneal injection of diquat at the 15th days and non-challenged pigs were injected intraperitoneally with the equal physiological saline amount at the same time. All the pigs were slaughtered after the vena cava blood was sampledon the 29th day. Using kits to detected the contents of plasma and intestine oxidative damage markers and the activities of digestive enzymes in jejunum chyme. After hematoxylin and eosin (HE) staining, using image analysis software to observed intestinal morphology structure and determined villus height, crypt depth, and calculated the value of the villus height to crypt depth (V/C). Using fluorescence quantitative PCR to detected the relative expression abundance of occludin and zonula occludens protein-1 (ZO-1) mRNA in jejunum. The results showed as follows: 1) diquat significantly increased the contents of malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PCO) and 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG) in plasma and intestine (P<0.01), significantly reduced the villus height and crypt depth in duodenum and jejunum and ileum (P<0.01), while significantly increased the V/C in duodenum and jejunum (P<0.01), and significantly increased the V/C of the ileum (P<0.05), significantly reduced the relative expression abundance of occludin andZO-1 mRNA in jejunum (P<0.01), and significantly reduced the activities of amylase, trypsase and lipase in jejunum chyme (P<0.01). 2) There were no significant difference on the contents of MDA, PCO and 8-OHdG in plasma and intestine when dietary supplementation of LA (P>0.05), as same as the villus height, crypt depth and V/C in duodenum, jejunum and ileum, the relative expression abundance of occludin andZO-1 mRNA in jejunum, the activities of amylase, trypsase and lipase in jejunum chyme (P>0.05). 3) Under the oxidative stress, dietary supplementation of LA significantly reduced the content of 8-OHdG in plasma (P<0.05), while significantly improved the villus height in duodenum and jejunum (P<0.05), and significantly improved crypt depth in ileum (P<0.05), significantly reduced V/C in jejunum (P<0.05) and ileum (P<0.01), significantly increased the relative expression abundance of occludin andZO-1 mRNA in jejunum (P<0.05), significantly improved the activity of amylase and trypsase in jejunum chyme (P<0.05). In conclusion, diquat caused oxidative stress in pigs is strong, leading to serious injury of intestinal structure and weakened intestinal digestive function. Dietary supplementation of 800 mg/kg of LA can suppress the oxidative stress caused by diquat injection on intestinal injury of finishing pigs, and may improve digestive function.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3264-3274]

diquat; lipoic acid; finishing pigs; oxidative stress; intestine

, professor, E-mail: guxianhong@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.030

2016-04-11

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃課題(2012CB124706)；國家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD39B02)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)

鮑偉光(1988—)，男，河南開封人，碩士研究生，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: baoweiguang2013@163.com

顧憲紅，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail: guxianhong@vip.sina.com

S828

A

1006-267X(2016)10-3264-11