崔志峰　于會(huì)國(guó)*　張　忠　王　慧　曾勇慶

(1.山東科技職業(yè)學(xué)院，濰坊261053；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018)

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山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系的建立

崔志峰1于會(huì)國(guó)1*張忠1王慧2曾勇慶2

(1.山東科技職業(yè)學(xué)院，濰坊261053；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018)

本試驗(yàn)旨在建立純一、穩(wěn)定的山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系。活體采集濟(jì)寧青山羊羔羊背部皮膚，采用機(jī)械分離與酶消化相結(jié)合的方法，分離外根鞘細(xì)胞，培養(yǎng)于含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和氫化可的松的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中，置5% CO2濃度的37 ℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)。待原代細(xì)胞長(zhǎng)成良好的單層后即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至第8～10代時(shí)，更換含EGF、IGF-Ⅰ、氫化可的松和FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。選取傳至第40代的外根鞘細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究與染色體分析。結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的細(xì)胞倍增時(shí)間為51.9 h，培養(yǎng)細(xì)胞的染色體數(shù)仍以2n=60為主，但是出現(xiàn)了非整倍體性染色體特征；免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果表明，該細(xì)胞系角蛋白19表達(dá)呈陽(yáng)性。結(jié)果提示，本試驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞確為由山羊毛囊干細(xì)胞分化來(lái)的外根鞘細(xì)胞，體外培養(yǎng)的山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系得到了成功建立。

毛囊外根鞘細(xì)胞；細(xì)胞系；濟(jì)寧青山羊；生長(zhǎng)特性；染色體數(shù)目

毛囊(hair follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛發(fā)生長(zhǎng)的皮膚附屬器官，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、合成多種特異角質(zhì)蛋白的功能以及周期性再生的能力。毛囊在形成與分化過(guò)程中至少涉及到20余種不同的細(xì)胞群，主要由毛乳頭、毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘和外根鞘等細(xì)胞組成[1-2]。其中，外根鞘細(xì)胞(outer root sheath cell,ORSC)作為一種重要的毛囊上皮細(xì)胞，因具有高度增生的潛能，在毛發(fā)再生、傷口愈合、初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊分化等生理過(guò)程中均起著重要作用而越來(lái)越受到關(guān)注。

自Wetering等[3]利用經(jīng)鈷源照射后的牛晶狀體包膜囊作為支持物，成功誘導(dǎo)人毛囊外根鞘細(xì)胞遷移出游離毛囊以來(lái)，已有不少學(xué)者針對(duì)外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)體系與技術(shù)進(jìn)行過(guò)改進(jìn)。其中，Oshima等[4]將分離的毛囊直接接種到塑料培養(yǎng)皿中，在控制培養(yǎng)液pH不高于7.2的條件下，貼壁毛囊周圍便可游離出外根鞘細(xì)胞，但該方法獲得的外根鞘細(xì)胞產(chǎn)量低且再生能力差，不便于進(jìn)行進(jìn)一步的研究與大量的應(yīng)用。迄今，已有多種細(xì)胞分離技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)方法運(yùn)用于外根鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)，其中，較為常用的培養(yǎng)方法有2種：一種是將分離的毛囊經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，然后接種于經(jīng)絲裂霉素處理的3T3細(xì)胞滋養(yǎng)層上，37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)[5-8]；另一種則是利用膠原包埋法進(jìn)行外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)，分離帶有外根鞘部位的毛囊，37 ℃下進(jìn)行胰酶消化處理，隨后將毛囊轉(zhuǎn)移至Ⅰ型和Ⅳ型膠原包被的塑料培養(yǎng)皿中，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待毛囊牢固貼附于培養(yǎng)皿底壁后，換用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)[9-10]。以上2種方法雖均能獲得毛囊外根鞘細(xì)胞，但仍存在少量非外根鞘細(xì)胞，且細(xì)胞傳至第8～10代后出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，以致無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

上述外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)多以人的毛囊為細(xì)胞的組織來(lái)源。對(duì)于其他哺乳動(dòng)物外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)，主要借鑒人毛發(fā)外根鞘細(xì)胞培養(yǎng)方法。研究表明，將分離得到的小鼠觸須毛囊接種于含有表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)及10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，且細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)先用經(jīng)絲裂霉素C處理的表皮細(xì)胞滋養(yǎng)層覆蓋，可成功分離得到純一的外根鞘細(xì)胞并穩(wěn)定生長(zhǎng)至第8～10代[11]。亦有學(xué)者在上述分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，成功分離培養(yǎng)了大鼠、牛、羊駝、豬、兔等動(dòng)物的毛外根鞘細(xì)胞及其他毛囊細(xì)胞[12-13]。盡管許多學(xué)者在動(dòng)物毛囊細(xì)胞培養(yǎng)方面進(jìn)行了大量的研究，但有關(guān)山羊毛囊細(xì)胞體外培養(yǎng)研究，尤其是外根鞘細(xì)胞系建立等方面的報(bào)道相對(duì)較少，可應(yīng)用于動(dòng)物毛囊研究方面的細(xì)胞株與細(xì)胞系亦不多。本試驗(yàn)在借鑒國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者分離、純化與接種方法的基礎(chǔ)上，擬對(duì)蛋白酶處理皮膚組織和次級(jí)毛囊分離方法進(jìn)行改進(jìn)，提高外根鞘細(xì)胞獲得率；傳代培養(yǎng)達(dá)第40代時(shí)，進(jìn)行外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)特性研究與染色體分析，以建立動(dòng)物毛囊研究方面的細(xì)胞株與細(xì)胞系。

因此，建立體外培養(yǎng)的毛囊外根鞘細(xì)胞系，完善外根鞘細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，可為進(jìn)一步研究動(dòng)物皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律及其影響因素奠定基礎(chǔ)。同時(shí)也可為進(jìn)一步研究毛囊細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化的研究建立離體的細(xì)胞模型。對(duì)山羊毛囊外根鞘細(xì)胞進(jìn)行研究，探討毛囊生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制以及羊的絨毛生長(zhǎng)退化機(jī)理，最終將為提高品種毛、絨、皮產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量等開(kāi)拓新的途徑。另外，以山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系為模型，研究外根鞘細(xì)胞與毛乳頭、內(nèi)根鞘、皮膚成纖維等細(xì)胞的相互作用，還可為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的毛囊再生、脫發(fā)禿頂?shù)忍峁┲匾獏⒖肌?/p>

1　材料與方法

1.1主要試劑與藥品

DMEM/F12培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液(keratinocyte-serum free medium,K-SFM)為Gibco公司產(chǎn)品；FBS為MDgenics公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；EGF為Sigma公司產(chǎn)品；胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和氫化可的松(hydrocortisone)為Peprotech公司產(chǎn)品；青霉素鈉(benzylpenicillin sodium)為山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate)為山東瑞陽(yáng)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；秋水仙堿(colchicine)為Sigma公司產(chǎn)品；Giemsa染液(Giemsa stain)為Fluka公司產(chǎn)品；細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)抗體為Acris公司產(chǎn)品；即用型Biotin SP-HRP免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒為北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

完全培養(yǎng)液：含10 ng/mL EGF、10 ng/mL IGF-Ⅰ、0.4 μg/mL氫化可的松和10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

工作培養(yǎng)液：含10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF、0.4 μg/mL氫化可的松的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液。

維持培養(yǎng)液：含10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF、0.4 μg/mL氫化可的松和2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

D-Hank’s液：由8 g/L NaCl、0.4 g/L KCl、0.06 g/L Na2HPO4·H2O、0.06 g/L KH2PO4、0.35 g/L NaHCO3和0.4 g/L苯酚紅組成。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：由8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.56 g/L Na2HPO4·H2O和0.2 g/L KH2PO4組成。

凍存培養(yǎng)液：含10%二甲基亞砜(DMSO)和30% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

Carnoy’s固定液：3倍體積的甲醇加1倍體積的冰醋酸，現(xiàn)配現(xiàn)用并于冰上保存。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

懷孕母羊購(gòu)自山東省濟(jì)寧市嘉祥縣種羊場(chǎng)，飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院畜牧科技試驗(yàn)站羊場(chǎng)。運(yùn)用外科手術(shù)的方法，隨機(jī)活體采集出生1～3日齡的羔羊背部面積約0.5 cm×0.5 cm的皮膚組織塊，將皮膚組織塊放入碘酒和酒精約30 s進(jìn)行消毒，再用生理鹽水洗凈酒精，迅速將皮膚組織塊放入無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液，于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。在12 h內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3外根鞘細(xì)胞原代培養(yǎng)用細(xì)胞培養(yǎng)板的處理

將預(yù)先培養(yǎng)的山羊皮膚成纖維細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入3 mL含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2濃度的飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)3～5 d細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合時(shí)，除去培養(yǎng)液。加入約3 mL的無(wú)菌1% Triton X-100于單層細(xì)胞上，37 ℃孵育30 min后，去除Triton X-100溶液，用無(wú)菌超純水沖洗干凈，置于4 ℃下備用。

1.4山羊毛囊外根鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)

將活體采集的皮膚組織塊帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)70%酒精浸泡消毒，D-Hank’s液洗凈酒精后，隨即置于體式顯微鏡下，用彎頭眼科剪和解剖針在培養(yǎng)皿中盡量刮去殘余裸露毛干及皮下脂肪，無(wú)菌生理鹽水沖洗去表面污物，碘酒擦拭及75%乙醇脫碘，用含有青霉素(400 U/mL)、鏈霉素(400 μg/mL)和泰樂(lè)菌素(Tylosin)(250 μg/mL)的D-Hank’s液再清洗皮膚組織塊，直至上清液清亮。浸入新的D-Hank’s液中帶入無(wú)菌間進(jìn)行下一步的操作。

進(jìn)入無(wú)菌間后，吸去D-Hank’s液，將前期進(jìn)行處理的皮膚組織塊，浸入約10 mL 0.25%中性蛋白酶，4 ℃消化過(guò)夜。然后放入新的D-Hank’s液中，手術(shù)刀在真皮與皮下組織之間切開(kāi)，再用無(wú)菌彎頭鑷揭去表皮層后，在體式顯微鏡下用滅菌鑷子夾住次級(jí)毛囊遠(yuǎn)端，順毛囊方向拔出毛囊，置于0.25%胰蛋白酶中消化5 min，隨后將游離毛囊均勻貼附于預(yù)先鋪有山羊皮膚成纖維細(xì)胞的胞外基質(zhì)的6孔培養(yǎng)板中，按照每孔3 mL加入完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待毛囊周圍遷移出大量細(xì)胞后，更換為相同體積的工作培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2濃度下啟動(dòng)原代培養(yǎng)。待游離出的毛囊外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)成單層后，消化移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d更換1次工作培養(yǎng)液。

1.5細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

當(dāng)毛囊外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)至?xí)蠣顟B(tài)后，進(jìn)行傳代。首先棄掉舊培養(yǎng)液，D-Hank’s液沖洗細(xì)胞1次，加入約1 mL濃度為0.25%的胰蛋白酶浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)秒。棄去液體后，再加入4 mL濃度為0.25%的胰蛋白酶，常溫下消化處理約5 min。當(dāng)觀察到有細(xì)胞貼附的瓶壁逐漸變白，且輕輕晃動(dòng)有微小細(xì)胞團(tuán)塊脫落時(shí)，便可加入6 mL完全培養(yǎng)液終止消化，吹打并懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞密度至10個(gè)/mL，取5 mL懸液加入25 cm2(最大培養(yǎng)面積)培養(yǎng)瓶中，按每瓶10 mL量加入工作培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d更換工作培養(yǎng)液1次。待外根鞘細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)至第8～10代時(shí)，更換等量的維持培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，以利于外根鞘細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代。挑選可穩(wěn)定遺傳的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期毛囊外根鞘細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并測(cè)定生長(zhǎng)曲線。

1.6山羊毛囊外根鞘細(xì)胞的Giemsa染色

將滅菌蓋玻片放入一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中，取2 mL第5代毛囊外根鞘細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待外根鞘細(xì)胞在蓋玻片上長(zhǎng)成良好單層后，取出玻片并浸入無(wú)水甲醇中固定15 min，再用新的無(wú)水甲醇沖洗細(xì)胞，隨即放入純的Giemsa染液中染色5～10 min。從Giemsa染液中取出玻片經(jīng)過(guò)干燥和二甲苯透明。最后，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

收獲第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期外根鞘細(xì)胞，采用細(xì)胞傳代的方法制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計(jì)數(shù)后，將密度為1.02×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL。每隔24 h取出3個(gè)孔的細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，每天的細(xì)胞數(shù)平均值為縱軸，繪制體外培養(yǎng)毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.8山羊毛囊外根鞘細(xì)胞的染色體核型分析

待傳代培養(yǎng)第40代的外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞移入25 mL培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)54 h。將0.5 μg/mL秋水仙素加入維持培養(yǎng)液中，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)約8 h，大部分細(xì)胞處于分裂中期。胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min，4 ℃離心10 min收集細(xì)胞。吸去上清液逐滴加入0.5 mL預(yù)溫37 ℃的低滲液(即0.075 mol/L的KCl溶液)并混勻，隨即補(bǔ)加低滲液至10 mL，用吸管輕輕吹打均勻，37 ℃孵育30 min。低滲處理后向管中加入1 mL新鮮Carnoy’s固定液進(jìn)行預(yù)固定，離心去上清后加入10 mL新鮮Carnoy’s液進(jìn)行固定，重復(fù)離心加液進(jìn)行再固定。將清潔載玻片進(jìn)行4 ℃預(yù)冷處理，取出后將其傾斜45°放置，在上方約1 m高度用吸管迅速滴加2～3滴固定后的細(xì)胞懸液，室溫干燥。最后，進(jìn)行Giemsa染色，中性樹(shù)脂封片，先用低倍鏡尋找良好分裂相，再用高倍鏡觀察。

1.9毛囊外根鞘細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

取1.5 mL第5代外根鞘細(xì)胞懸液均勻接種于清潔無(wú)菌的蓋玻片上，置于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待外根鞘細(xì)胞長(zhǎng)至蓋玻片80%以上面積時(shí)，取出蓋玻片經(jīng)PBS清洗后，用-20 ℃預(yù)冷的醋酸乙醇固定液固定20 min，PBS清洗3次(每次3 min)。按照即用型Biotin SP-HRP免疫組化試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行細(xì)胞角蛋白19(CK-19)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。最后用DAB于暗處顯色3～10 min，蒸餾水清洗后，觀察，照相。

1.10毛囊外根鞘細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇

選擇第5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，利用傳代培養(yǎng)的方法制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min，離心10 min，取上清后加入凍存培養(yǎng)液(含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，分裝入5 mL無(wú)菌凍存管中，封口，標(biāo)記。將凍存管依次置于4 ℃ 1 h、-20 ℃ 1 h、-70 ℃ 12 h，最后移入液氮中長(zhǎng)期保存細(xì)胞。

復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，用40 ℃溫水快速解凍細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入15 mL離心管，逐滴加入10 mL維持培養(yǎng)液緩慢稀釋凍存液，無(wú)菌吸管輕輕吹打混勻后，1 000 r/min離心10 min，棄上清。再用維持培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，按5×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶。

1.11細(xì)胞活率與貼壁率的測(cè)定

運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞凍存前和復(fù)蘇后的活率，并觀察細(xì)胞復(fù)蘇后的貼壁情況，統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞活率與貼壁率。

1.12毛囊外根鞘細(xì)胞的形態(tài)回復(fù)試驗(yàn)

收獲傳至第40代的生長(zhǎng)良好的單層外根鞘細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2濃度的條件下，用10 mL維持培養(yǎng)液和10 mL工作培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，觀察外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

2　結(jié)果與分析

2.1原代培養(yǎng)的毛囊外根鞘細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

利用貼壁法分離毛囊外根鞘細(xì)胞，在含完全培養(yǎng)液中，4～5 d便可見(jiàn)毛囊外根鞘邊緣向外游離生長(zhǎng)出單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形，隨后伸展成多角形的形態(tài)(圖1-a)。培養(yǎng)7 d即可明顯看到大量細(xì)胞從外根鞘邊緣生長(zhǎng)出來(lái)(圖1-b)。隨著游離生長(zhǎng)細(xì)胞的增多，生長(zhǎng)速率逐漸加快，在15 d時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在倒置相差顯微鏡下觀察，可見(jiàn)游離出的毛囊外根鞘細(xì)胞以短梭形和多角形為主，細(xì)胞飽滿，透明度高，胞體向外伸出2～4個(gè)片足，胞核卵圓形，胞質(zhì)較少(圖1-c)。隨后細(xì)胞向四周呈克隆狀生長(zhǎng)，形成致密單層后細(xì)胞變化為短梭狀平行排列(圖1-d)。

圖1　體外培養(yǎng)的青山羊原代毛囊外根鞘細(xì)胞

2.2毛囊外根鞘細(xì)胞Giemsa染色的觀察

體外培養(yǎng)的毛囊外根鞘細(xì)胞經(jīng)Giemsa染色后，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，胞體近中央處有橢圓形的細(xì)胞核，呈深藍(lán)色，其中可見(jiàn)1～2個(gè)核仁(圖2-a)。觀察處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的外根鞘細(xì)胞，視野中可見(jiàn)較多量的有絲分裂相細(xì)胞，采用該染色法可較清晰地顯示出細(xì)胞分裂的不同時(shí)相(圖2-b)。當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞形成良好單層(即達(dá)到匯合狀態(tài))后，經(jīng)染色可見(jiàn)只有極少量細(xì)胞處于分裂周期(M期)，大部分細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制(圖2-c)。其中，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)胞核分裂，胞質(zhì)未分裂的現(xiàn)象，形成合胞體狀(第40代，圖2-d)。

圖2　體外培養(yǎng)的青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞Giemsa染色

2.3傳代培養(yǎng)的毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

傳代培養(yǎng)的外根鞘細(xì)胞與其原代細(xì)胞在形態(tài)及生長(zhǎng)速度上均無(wú)明顯差異，細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂依然十分旺盛。單層細(xì)胞傳代約7 d后便可重新長(zhǎng)成單層，其對(duì)于胰蛋白酶消化的敏感性也較原代培養(yǎng)細(xì)胞明顯增強(qiáng)。從體外培養(yǎng)的外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(圖3)可以看出，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的前2 d為遲緩期；3～5 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；5 d后便進(jìn)入平穩(wěn)期和衰退期。細(xì)胞群體倍增時(shí)間為51.9 h，說(shuō)明外根鞘細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后其生長(zhǎng)與分裂能力依然旺盛。

圖3　青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4毛囊外根鞘細(xì)胞的染色體分析

選取傳至第40代的細(xì)胞，進(jìn)行染色體標(biāo)本計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，濟(jì)寧青山羊染色體為2n=60的細(xì)胞占主體，但是個(gè)別細(xì)胞的染色體發(fā)生缺失與丟失，出現(xiàn)了典型的非整倍體性細(xì)胞系染色體特征，說(shuō)明體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性有影響作用；然而，在選取進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞中，擁有60條染色體的細(xì)胞數(shù)仍可占總細(xì)胞數(shù)的58.3%，且這些細(xì)胞的核型均正常(圖4)。因此，所建立的細(xì)胞系確為青山羊細(xì)胞系。

2.5毛囊外根鞘細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的低傳代次數(shù)(第5代)的外根鞘細(xì)胞的骨架蛋白-細(xì)胞角蛋白19表達(dá)情況。顯微鏡觀察結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)呈黃褐色，表明外根鞘細(xì)胞角蛋白19表達(dá)呈陽(yáng)性(圖5)，而角蛋白19為毛外根鞘細(xì)胞和皮膚干細(xì)胞的標(biāo)記，因此證實(shí)本試驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞確為由毛囊干細(xì)胞分化來(lái)的外根鞘細(xì)胞。

2.6毛囊外根鞘細(xì)胞的活率與貼壁率

利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞凍存前24 h的平均活率及細(xì)胞復(fù)蘇后24 h的平均活率與貼壁率，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞東存前和復(fù)蘇后平均活率分別為94.4%和92.1%，復(fù)蘇24 h后約有85%細(xì)胞貼附瓶底生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，凍存和復(fù)蘇對(duì)傳代細(xì)胞活力狀況的損害較小，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖6)。

2.7毛囊外根鞘細(xì)胞的形態(tài)回復(fù)

將傳代培養(yǎng)至第40代的外根鞘細(xì)胞，在工作培養(yǎng)液進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)。7 d后可觀察到，在工作培養(yǎng)液中的外根鞘細(xì)胞，其形態(tài)由原來(lái)的以成纖維樣細(xì)胞形態(tài)為主，逐漸轉(zhuǎn)變成以內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài)為主(圖7-a)；而外根鞘細(xì)胞在含維持培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)，其形態(tài)仍以成纖維樣細(xì)胞形態(tài)為主(圖7-b)。

3　討　論

動(dòng)物毛囊是由多種細(xì)胞組成的皮膚附屬器官，對(duì)毛囊內(nèi)各種細(xì)胞的體外培養(yǎng)是揭示毛囊發(fā)育機(jī)制的基礎(chǔ)。毛囊外根鞘細(xì)胞在組織發(fā)生、生物學(xué)特性等方面與毛囊干細(xì)胞密切相關(guān)，獲得可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的毛囊外根鞘細(xì)胞系，可為研究外根鞘細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞的相互作用，最終在體外成功誘導(dǎo)毛發(fā)再生奠定基礎(chǔ)。

a：第40代外根鞘細(xì)胞染色體數(shù)；b：第40代外根鞘細(xì)胞分裂中期染色體。

a: chromosome count of passage 40 outer root sheath cells; b: passage 40 outer root sheath cells at metaphase of cell division.

圖4第40代青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞的染色體分析

Fig.4Chromosome analysis of passage 40 outer root sheath cells of grey goats

圖5　青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色

a：凍存前的毛囊外根鞘細(xì)胞；b:復(fù)蘇后24 h的毛囊外根鞘細(xì)胞。

a: outer root sheath cells before cryopreservation; b: outer root sheath cells after 24 h of recovery.

圖6凍存前與復(fù)蘇后的青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞

Fig.6Outer root sheath cells of grey goats before cryopreservation and after recovery (100×)

a:培養(yǎng)于工作培養(yǎng)液中的外根鞘細(xì)胞；b:培養(yǎng)于維持培養(yǎng)液中的外根鞘細(xì)胞。

a: outer root sheath cells cultured in working culture medium; b: outer root sheath cells cultured in feeding medium.

圖7第40代青山羊毛囊外根鞘細(xì)胞的形態(tài)回復(fù)

Fig.7Morphology recovery of passage 40 outer root sheath cells of grey goats (100×)

3.1皮膚成纖維細(xì)胞的胞外基質(zhì)對(duì)外根鞘細(xì)胞貼壁的促進(jìn)作用

以往對(duì)于毛囊外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)，常用的方法是將細(xì)胞接種于輻射或絲裂霉素處理過(guò)的滋養(yǎng)層細(xì)胞上，培養(yǎng)液含血清和一些添加劑。這種培養(yǎng)方法不但準(zhǔn)備步驟多，而且操作過(guò)程中易出現(xiàn)污染[14]。

本試驗(yàn)將游離毛囊接種于預(yù)先鋪有山羊皮膚成纖維細(xì)胞的胞外基質(zhì)的培養(yǎng)瓶中，在毛囊外根鞘細(xì)胞游離出來(lái)后，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，經(jīng)10～15 d便可形成一層膜相結(jié)構(gòu)。分析其中的原因，可能是由于皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)毛囊外根鞘細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而且，體內(nèi)狀態(tài)下的成熟毛囊，外根鞘細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞緊密相連，關(guān)系極為密切。

本試驗(yàn)所建立的這種方法，不僅可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量單層外根鞘細(xì)胞，而且操作步驟較建立滋養(yǎng)層細(xì)胞法更簡(jiǎn)便易行，并且，有效地避免了操作過(guò)程中的微生物污染與雜細(xì)胞的混入。此外，利用青山羊皮膚成纖維細(xì)胞的胞外基質(zhì)做培養(yǎng)瓶表面覆蓋物，能夠?yàn)樵囵B(yǎng)的細(xì)胞提供更為接近體內(nèi)的細(xì)胞外環(huán)境，有利于刺激毛囊外根鞘細(xì)胞重新恢復(fù)分裂能力，這也是能夠成功進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)的重要條件之一。

3.2酶消化法與機(jī)械分離法相結(jié)合

1982年，Wells[15]采用機(jī)械分離方法獲得游離毛囊，然后將其直接培養(yǎng)于塑料培養(yǎng)皿中。該方法雖然可獲得毛囊外根鞘細(xì)胞，但是游離毛囊需經(jīng)15～20 d才有細(xì)胞外遷，且外根鞘細(xì)胞的產(chǎn)量較低，再生能力較差，無(wú)法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1994年，Kurata等[16]將分離出的毛囊經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，獲得外根鞘細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，但該方法不僅前期準(zhǔn)備煩瑣費(fèi)時(shí)，且易出現(xiàn)細(xì)胞污染。此后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)毛囊外根鞘細(xì)胞的分離培養(yǎng)相繼展開(kāi)了研究，采用機(jī)械分離毛囊貼壁方法培養(yǎng)，雖然容易成功，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且細(xì)胞增殖緩慢；而采用單純酶解方法進(jìn)行培養(yǎng)，也能獲得成功，但是，存在其他細(xì)胞污染與微生物污染的可能性[17-18]。本試驗(yàn)將在2種培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)和結(jié)合既具有操作簡(jiǎn)便、獲得細(xì)胞量大、細(xì)胞貼壁好等優(yōu)點(diǎn)，又可有效地避免細(xì)胞增殖緩慢、不易傳代、細(xì)胞與微生物污染等方面的不足。

3.3生長(zhǎng)因子對(duì)毛囊外根鞘細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

本試驗(yàn)在培養(yǎng)液中添加了10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF和0.4 μg/mL氫化可的松，這些生長(zhǎng)因子是能夠順利啟動(dòng)外根鞘細(xì)胞原代培養(yǎng)以及成功進(jìn)行傳代培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。

大量研究表明，向培養(yǎng)液中添加適宜濃度的生長(zhǎng)因子，對(duì)毛囊外根鞘細(xì)胞的貼壁與增殖具有明顯的促進(jìn)作用[19-20]，許多學(xué)者在哺乳動(dòng)物毛囊外根鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)中使用了IGF-Ⅰ和EGF，發(fā)現(xiàn)它們能夠促進(jìn)毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)[21-22]。IGF-Ⅰ具有胰島素樣代謝作用，能夠刺激毛囊外根鞘細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞以及黑色素細(xì)胞的增殖與分化。運(yùn)用免疫組化方法證實(shí)，在毛囊生長(zhǎng)周期的不同階段均有IGF-Ⅰ存在于動(dòng)物毛囊外根鞘細(xì)胞和毛囊其他細(xì)胞中，表明IGF-Ⅰ對(duì)毛囊細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)有著廣泛且必需的作用。EGF是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的外源性生長(zhǎng)因子，能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)多種細(xì)胞增殖有刺激作用。國(guó)內(nèi)外研究者運(yùn)用免疫組織化學(xué)和放射自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)，離體或在體狀態(tài)下毛囊外根鞘部位均有EGF和EGF受體的存在。提示，EGF與毛囊外根鞘細(xì)胞上的EGF受體結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和羥脯氨酸的合成，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，引起外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)、合成與分泌活動(dòng)的變化[23]。近年來(lái)，一些學(xué)者就糖皮質(zhì)激素(氫化可的松)對(duì)毛囊外根鞘細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響作了深入的研究。發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的外根鞘細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞均有氫化可的松及其受體的表達(dá)，并且向培養(yǎng)體系中添加氫化可的松對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的有絲分裂作用[24]。

本試驗(yàn)在前人研究和對(duì)比試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)液中添加了10 ng/mL IGF-Ⅰ、10 ng/mL EGF和0.4 μg/mL氫化可的松，這些生長(zhǎng)因子順利協(xié)助啟動(dòng)了外根鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)。

3.4非毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與去除

非毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與去除是保證外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)的原代啟動(dòng)及成功傳代的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清成分含有多種黏附因子，可促進(jìn)細(xì)胞的分化與形態(tài)變化，且有利于成纖維細(xì)胞的增殖，從而抑制了上皮樣細(xì)胞的生長(zhǎng)[25-26]。Jahoda等[27]采用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)原代表皮干細(xì)胞與毛外根鞘細(xì)胞，接種96 h后觀察發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞的增殖得到明顯抑制，而表皮干細(xì)胞與毛外根鞘細(xì)胞的增殖時(shí)間縮短、增殖細(xì)胞數(shù)量增加。近年來(lái)無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液越來(lái)越多的應(yīng)用于毛囊干細(xì)胞與毛外根鞘細(xì)胞的純化培養(yǎng)，無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液富含銅、硒、鋅等微量元素和豐富的必需氨基酸，可以作為外根鞘細(xì)胞培養(yǎng)與純化的最好選擇。除培養(yǎng)液與血清能夠影響毛外根鞘細(xì)胞純度外，游離毛囊的分離與接種方法亦可影響毛外根鞘與其他細(xì)胞的比例。Limat等[28]首先在顯微鏡下直接從新鮮采集皮膚中拔出毛囊，隨后制成游離毛囊混懸液接種于培養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng)，該方法雖然個(gè)別游離毛囊能夠貼壁并向周圍生長(zhǎng)出細(xì)胞，然而多數(shù)分離毛囊因未貼壁或貼壁不牢而無(wú)法向外游離生長(zhǎng)細(xì)胞。且該方法因前期未對(duì)皮膚組織樣品進(jìn)行消化處理，所獲毛囊其外根鞘部分受損傷嚴(yán)重，分離出的細(xì)胞中皮脂腺細(xì)胞及成纖維細(xì)胞居多，不利于進(jìn)一步的外根鞘細(xì)胞純化培養(yǎng)。Hoeller等[29]將分離毛囊經(jīng)胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液處理后，加入到培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了較多量的外根鞘細(xì)胞，然而該方法在分離毛囊時(shí)亦有部分外根鞘遺留在組織內(nèi)，且易混雜生長(zhǎng)較多成纖維細(xì)胞，影響后期的細(xì)胞純化。

本試驗(yàn)在借鑒國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者分離與接種方法的基礎(chǔ)上，首先，利用4 ℃ 0.25%中性蛋白酶對(duì)皮膚組織進(jìn)行預(yù)處理，保證所分離得到的游離次級(jí)毛囊外根鞘部分的完整性；其次，將分離的次級(jí)毛囊采用先貼附培養(yǎng)基質(zhì)再進(jìn)行0.25%胰蛋白酶消化處理以及加入少量含高濃度血清(10% FBS)培養(yǎng)液促貼壁等試驗(yàn)手段，提高了游離毛囊的貼壁率及獲得細(xì)胞中外根鞘細(xì)胞所占比例，利于進(jìn)一步獲取純一的外根鞘細(xì)胞。

4　結(jié)　論

本試驗(yàn)利用皮膚成纖維細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)和機(jī)械分離與酶消化結(jié)合方法成功啟動(dòng)了外根鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)，添加多種生長(zhǎng)因子成功建立了山羊毛囊外根鞘細(xì)胞系。該細(xì)胞系已穩(wěn)定傳至第40代，生長(zhǎng)分裂狀態(tài)良好，細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為51.9 h。經(jīng)細(xì)胞染色體分析與形態(tài)回復(fù)的試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明，所建毛囊外根鞘細(xì)胞系特征明顯，可為研究毛囊生長(zhǎng)與分化機(jī)制，尤其是毛囊主要細(xì)胞間的相互作用機(jī)制提供良好模型。

[1]崔志峰,趙晶,王慧,等.不同培養(yǎng)基對(duì)山羊毛囊體外培養(yǎng)的影響研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版,2008,43(5):1-5.

[2]董彬,崔志峰,尹遜河,等.濟(jì)寧青山羊皮膚毛囊的組織學(xué)特性研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,41(2):258-262.

[3]WETERINGS P J J M,VERMORKEN A J M,BLOEMENDAL H.A method for culturing human hair follicle cells[J].British Journal of Dermatology,1981,104(1):1-5.

[4]OSHIMA H,ROCHAT A,KEDZIA C,et al.Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells[J].Cell,2001,104(2):233-245.

[5]唐建兵,陳璧,湯朝武,等.人毛囊外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)[J].中華燒傷雜志,2003,19(1):47-48.

[6]BAK S S,SUNG Y K,KIM S K.7-Phloroeckol promotes hair growth on human folliclesinvitro[J].Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology,2014,387(8):789-793.

[7]FRESHNEY R I.Culture of animal cells:a manual of basic technique[M].5th ed.New York:Wiley-Liss,2000:149-175.

[8]GLEDHILL K,GARDNER A,JAHODA C A B.Isolation and establishment of hair follicle dermal papilla cell cultures[J].Methods in Molecular Biology,2013,989:285-292.

[9]陳杏曄,李凡,劉愛(ài)軍.毛囊細(xì)胞高效分離培養(yǎng)方法的建立[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,31(5):807-809.

[10]程賽,張汝芝,朱靜,等.人毛囊外根鞘及毛乳頭細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)觀察[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2015,29(1):32-35.

[11]LAKO M,ARMSTRONG L,CAIRNS P M,et al.Hair follicle dermal cells repopulate the mouse haematopoietic system[J].Journal of Cell Science,2002,115(20):3967-3974.

[12]GUAN W J,MA Y H,DING H,et al.The establishment of fibroblast cell line and its biological characteristic research in small tailHansheep[J].Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences,2005,36(5):511-516.

[13]BEHRINGER R R,LEWIN T M,QUAIFE C J,et al.Expression of insulin-like growth factor Ⅰ stimulates normal somatic growth in growth hormone-deficient transgenic mice[J].Endocrinology,1990,127(3):1033-1040.

[14]ASAKAAWA K,TOYOSHIMA K E,ISHIBASHI N,et al.Hair organ regeneration via the bioengineered hair follicular unit transplantation[J].Scientific Reports,2012,2:424.

[15]WELLS J.A simple technique for establishing cultures of epithelial cells[J].British Journal of Dermatology,1982,107(4):481-482.

[16]KURATA S, ITAMI S,TERASHI S,et al.Successful transplantation of cultured human outer root sheath cells as epithelium[J].Annals of Plastic Surgery,1994,33(2):290-294.

[17]XU Z C,ZHANG Q,LI H.Differentiation of human hair follicle stem cells into endothelial cells induced by vascular endothelial and basic fibroblast growth factors[J].Molecular Medicine Reports,2014,9(1):204-210.

[18]KRUGLUGER W,ROHRBACHER W,LACIAK K,et al.Reorganization of hair follicles in human skin organ culture induced by cultured human follicle-derived cells[J].Expermental Dermatology,2005,14(8):580-585.

[19]LU Z F,WU J J,LIU R Q,et al.Expressions ofbFGF,ET-1 andSCFin dermal papilla cells and the relation to their biological properties[J].Journal of Zhejiang University:Medical Sciences,2004,33(4):296-299.

[20]劉莉,張璐,劉強(qiáng),等.人參對(duì)小鼠觸須毛囊體外培養(yǎng)的影響[J].今日藥學(xué),2013,23(4):217-219.

[21]FREEMAN M E,KANYICSKA B,LERANT A,et al.Prolactin:structure,function,and regulation of secretion[J].Physiological Reviews,2000,80(4):1523-1631.

[22]SENNETT R,RENDL M.Mesenchymal-epithelial interactions during hair follicle morphogenesis and cycling[J].Seminars in Cell & Developmental Biology,2012,23(8):917-927.

[23]RENDL M,LEWIS M,FUCHS E.Molecular dissection of mesenchymal-epithelial interactions in the hair follicle[J].PLoS Biology,2005,3(11):e331.

[24]TUMBAR T,GUASCH G,GRECO V,et al.Defining the epithelial stem cell niche in skin[J].Science,2004,303(5656):359-363.

[25]KRAUSE K,FOITZIK K.Biology of the hair follicle:the basics[J].Seminats in Cutaneous Medicine and Surgery,2006,25(1):2-10.

[26]TAUSCHE A K,SKARIA M,B?HLEN L,et al.An autologous epidermal equivalent tissue-engineered from follicular outer root sheath keratinocytes is as effective as split-thickness skin autograft in recalcitrant vascular leg ulcers[J].Wound Repair and Regeneration,2003,11(4):248-252.

[27]JAHODA C,REYNOLDS A.Skin stem cells-a hairy issue[J].Nature Medicine,2000,6(10):1095-1097.

[28]LIMAT A,BREITKREUTZ D,HUNZIKER T,et al.Outer root sheath (ORS) cells organize into epidermoid cyst-like spheroids when cultured inside Matrigel:a light-microscopic and immunohistological comparison between human ORS cells and interfollicular keratinocytes[J].Cell and Tissue Research,1994,275(1):169-176.

[29]HOELLER D,HUPPERTZ B,ROOS T C,et al.An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts[J].Expermental Dermatology,2001,10(4):264-271.

Author, CUI Zhifeng, lecturer, E-mail: cuizfeng@sdau.edu.cn

*Contributed equally

(責(zé)任編輯王智航)

Establishment of Outer Root Sheath Cell Line of Goats

CUI Zhifeng1YU Huiguo1*ZHANG Zhong1WANG Hui2ZENG Yongqing2

(1. Shandong Vocational College of Science and Technology, Weifang 261053, China; 2. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

This study was conducted to establish a pure and genetically stable outer root sheath cell (ORSC) line of goats. Dorsal skin of lambs ofJininggrey goats was collected under living condition. The method of mechanical separation conjugation with enzyme digestive was conducted to obtain ORSCs. ORSCs were cultured in keratinocyte-serum free medium with epithelial growth factor (EGF), insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ), and hydrocortisone for primary culture under the conditions of 5% carbon dioxide and 37 ℃. After primary cells spread the culture flask, the subculture was started. The cells at passages 8 to 10 were then cultured in DMEM/F12 with EGF, IGF-Ⅰ, hydrocortisone and FBS for long-term culture. Growth characteristic and karyotype analysis were carried out using passage 40 cells. The results showed that theinvitrocultured cell population cost 51.9 h to perform doubling, the most of chromosome type was 2n=60 type, but appeared the uncompleted chromosome; the immunocytochemecal results showed that cytokeratin-19 was positively expressed in the cell line. In conclusion， the cells separated and cultured in the present study were ORSCs that differentiated from stem cells of hair follicle of goats, and a ORSC line of goatsinvitroculture was successfully established.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3207-3216]

outer root sheath cell; cell line;Jininggrey goat; growth characteristic; chromosome count

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.024

2016-04-02

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金“山羊毛囊發(fā)育和毛發(fā)再生機(jī)制與毛囊體外重塑研究”(2014BSB09001)；山東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新體系蝦蟹類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-15-011-02)

崔志峰(1983—)，男，遼寧本溪人，講師，博士研究生，主要從事動(dòng)物健康養(yǎng)殖研究。E-mail： cuizfeng@sdau.edu.cn

S826

A

1006-267X(2016)10-3207-10

*同等貢獻(xiàn)作者