周文才，左繼林，占志勇，王玉娟，幸偉年，龔春

(江西省林業(yè)科學院，江西　南昌330013)

?

不同種源的三葉木通ITS序列分析及親緣關(guān)系*

周文才，左繼林，占志勇，王玉娟，幸偉年，龔春

(江西省林業(yè)科學院，江西南昌330013)

對9份不同種源三葉木通樣本的核糖體DNA ITS區(qū)序列進行測定與分析，同時分析遺傳距離并構(gòu)建NJ樹。結(jié)果表明，參試的9份三葉木通樣本的ITS區(qū)序列全長均為653bp，其中ITSl序列長度為269bp，ITS2序列長度為221bp；整個ITS序列區(qū)共有7個(1.07%)變異位點，其中ITS1、5.8S和ITS2的變異位點分別為4、0和3個，這些變異位點可作為三葉木通不同種源鑒別的信息位點；各序列間的遺傳分化距離為0.002～0.008，聚類結(jié)果9個樣本構(gòu)成2個分支，并顯示出三葉木通的親緣關(guān)系與其地理分布有一定關(guān)系。

三葉木通；ITS；親緣關(guān)系；種源

三葉木通(Akebiatrifoliata)為木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia)落葉木質(zhì)藤本，在中國黃河流域以南各省(區(qū))都有分布[1]。三葉木通為中國傳統(tǒng)的中藥材，其根、藤莖、果實等具有通筋活絡(luò)、解毒、消炎等功效[2]，其果實為肉質(zhì)蓇葖果，色香味俱全，是珍稀的綠色水果和保健食品。此外，三葉木通的莖蔓柔軟多姿，具有較好的觀賞價值，因此三葉木通是極具開發(fā)價值的野生植物資源。

當前國內(nèi)外對三葉木通的研究還處于起步階段，主要集中在生物性狀觀測[3～4]、育苗繁殖培育[5～6]、成分分析[7～8]等方面，而對三葉木通的資源評價方面研究很少。李秀華等[9]曾對73份三葉木通種質(zhì)資源進行了表型研究，結(jié)果顯示三葉木通存在豐富的形態(tài)學變異，其中果實的各指標變異幅度最大。到目前為止，在分子水平對三葉木通種質(zhì)資源評價還未見報道。

核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)又叫ITS(internal transcribed spacer)序列，由ITSl、5.8S和ITS2 3個部分組成。ITS序列分析技術(shù)因其技術(shù)簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，近年來已被廣泛用于植物種內(nèi)變異及近緣植物屬間、種間的分子系統(tǒng)發(fā)育學等研究[10～12]。為此本文通過測定三葉木通9個種源材料rDNA的ITS序列并進行比較分析，旨在從分子水平探討不同種源三葉木通的種內(nèi)變異情況及其親緣關(guān)系。

1　材料和方法

1.1材料

采集三葉木通新鮮葉片，酒精表面消毒后置于硅膠中干燥保存，用于DNA提取，具體材料及來源見表1。

表1　9個三葉木通樣本的采集信息Tab.1　The gathering information of 9 samples of Akebia trifoliata

1.2DNA的提取

稱取約0.5g干燥三葉木通葉片，加入液氮進行研磨，直至成粉末，DNA提取采用SDS-CTAB法操作[13]。

1.3ITS序列的擴增及測序

用于擴增ITS序列的引物參照Kitaoka等[14]實驗，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，其中上游引物為Akebi-F(5'-GCTCCTACCGATTGAATGGT -3')，下游引物為Ake-26SR(5'-GTAAGTTTCTTCTCCTCCGC-3')。PCR擴增反應于Gen AMP 9700擴增儀上進行，擴增反應體系為25μL，其中0.2μL Taq DNA 聚合酶( 2.5U/μL)、2.5μL 10×Buffer、2.0μL dNTP(含Mg2+2.5 pmol/μL)，2μL模板DNA(20ng/μL)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，最后加ddH2O 定容至25μL。PCR反應程序為，94℃預變性4min；94℃變性1min，55℃退火30s,72℃延伸1min,共計30個循環(huán)；最后延伸72℃ 5min；4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，為保證測序質(zhì)量，根據(jù)上下引物以ABI 3730 DNA測序儀進行雙向測序，然后根據(jù)測序結(jié)果拼接出完整序列。PCR產(chǎn)物純化、序列測定和拼接工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4ITS序列分析

根據(jù)Gen Bank中木通的ITS序列范圍確定rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)ITSl、5.8S及 ITS2的界限，獲得ITS全長序列，將所得序列利用DNAMAN v6.0軟件進行比對，并輔以人工校對，利用MEGA v5.1軟件計算遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1三葉木通ITS序列的長度及變異

獲得測序數(shù)據(jù)后，根據(jù)Gen Bank中三葉木通的ITS序列范圍(Gen Bank登錄號為FJ868728)，確定三葉木通rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)ITSl、5.8S和ITS2序列，最終得到ITS全長序列。測得9個樣本ITSl、5.8S rDNA和ITS2序列全長均為653bp，其中ITSl序列長度為269bp，5.8S rDNA序列長度為163bp，ITS2序列長度為221bp，ITS各區(qū)間長度的一致性表明ITS序列長度保守性很高。整個ITS序列區(qū)一共有7個堿基位點發(fā)生了變異(表2)，占了總序列的1.07%。此外ITS變異位點穩(wěn)定，其堿基的變異類型分別是第132位堿基的“T”變?yōu)椤癎”、第133位堿基的“G”變?yōu)椤癆”、第222位堿基的“G”變?yōu)椤癆”、第227位堿基的“C”變?yōu)椤癆”、第533位堿基的“G”變?yōu)椤癆”、第565位堿基的“T”變?yōu)椤癈”、 第591位堿基的“T”變?yōu)椤癈”，這些位點可作為不同種質(zhì)材料DNA指紋鑒別的信息位點。

表2　三葉木通ITS序列變異位點Tab.2　The variable sites in the whole ITS sequence of Akebia trifoliata

分析發(fā)現(xiàn)三葉木通樣品中ITS各區(qū)段序列發(fā)生變異的位點數(shù)不同，其中ITSl變異位點為4個，占其總位點數(shù)的1.49%；ITS2序列變異位點有3個，占其總位點數(shù)的1.36%；而5.8S序列位點非常穩(wěn)定，沒有變異位點。

2.2不同種源三葉木通遺傳距離及系統(tǒng)樹構(gòu)建

利用MEGA v5.1軟件，以Kimura-2參數(shù)分析不同產(chǎn)地三葉木通的遺傳距離(見表3)。得到樣品間的遺傳距離介于0.002～0.008之間，表明三葉木通各個樣本之間ITS區(qū)存在遺傳變異，但變異率較低，其中鶴城區(qū)樣本和武寧、玉山、寧國樣本間的遺傳距離最大。

基于遺傳距離對9個三葉木通樣本構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。9個樣本可分為兩支，其中玉山、寧國、武寧、景德鎮(zhèn)、浮梁樣本聚在一起組成了一個分支；另一個分支上，鶴峰縣和鶴城區(qū)樣本先聚在一起，然后依次與凱里、南昌樣本聚在一起組成分支。以上聚類結(jié)果表明不同種源三葉木通的親緣關(guān)系與其地理分布有一定的關(guān)系。

表3　ITS基因序列之間的遺傳分化距離Tab.3　The genetic differentiation distance of ITS spacers

圖1　基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic tree based on ITS sequence

3　結(jié)論與討論

ITS序列的進化速率較快，物種間變異豐富，因此非常適用于種間及近緣屬間等物種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究，而在種內(nèi)變異分析方面，不同的物種中其應用價值不同。如在一些物種內(nèi)ITS不存在位點多態(tài)性[15～16]，而在一些物種中ITS存在較豐富的變異，并可用于物種的種內(nèi)不同居群的分子鑒定及親緣關(guān)系研究。如嚴寒靜等[17]對不同種源何首烏(Fallopiamultiflor)的ITS 區(qū)序列進行測定分析，結(jié)果支持將田陽何首烏作為何首烏的一個變種—棱枝何首烏。王潔等[18]對不同產(chǎn)區(qū)厚樸(Magnoliaofficinalis)的ITS 序列分析及親緣關(guān)系鑒定，表明ITS的位點變異與厚樸部分葉形變化有吻合，但無必然聯(lián)系。易駿等[19]研究了不同產(chǎn)地孩兒參(Pseudostellariaheterophylla)的ITS序列差異，為孩兒參的道地性鑒別提供了鑒別依據(jù)。本文通過測定并比較三葉木通的ITS序列，發(fā)現(xiàn)9個樣本ITS序列全長均為653bp，其中ITSl序列長度269bp，5.8S rDNA序列長度163bp，ITS2序列長度221bp，ITS序列長度表現(xiàn)出高度的保守性。分析發(fā)現(xiàn)各樣本間的堿基差異不大，這種較小的差異性也反映了其遺傳的穩(wěn)定性。其中，ITS1和ITS2序列變異位點共有7個，其變異類型有4種(包括T-G、A-G、A-C、T-C)，這些差異的位點可以作為不同種源三葉木通的識別特征，這也說明ITS序列對于不同種源的三葉木通種質(zhì)鑒定研究具有一定指導意義。此外，5.8S rDNA的長度都為163bp，這和前人研究被子植物rDNA ITS區(qū)中5.8S序列長度非常保守的結(jié)果一致[20]。

根據(jù)遺傳距離進行聚類分析，可以直觀地了解不同種源樣品間的親緣關(guān)系。本文利用三葉木通的ITS序列進行聚類分析，結(jié)果顯示來自贛東北地區(qū)的樣本和來自安徽寧國的樣本聚在了一起，而來自凱里和鶴城區(qū)等地樣本聚在一支，表明三葉木通的親緣關(guān)系與其地理分布有一定相關(guān)性，也反映了三葉木通的ITS序列差異性與其地理分布有一定相關(guān)性。

在開展植物物種鑒定時，Chase等[21]研究顯示ITS2序列與ITS全長序列的物種鑒定效率相當，而ITS2序列長度只有ITS序列的三分之一，因此認為ITS2序列具有較高的擴增效率。Chen等[22]也提出利用ITS2序列鑒定藥用植物品種。本實驗結(jié)果顯示三葉木通種內(nèi)ITS變異位點一共只有7個，其中ITS1變異位點4個，ITS2變異位點3個，如果僅僅根據(jù)ITS中的部分序列將很難對不同種源的樣本進行全面分析，因此在利用ITS序列開展植物種內(nèi)變異及親緣關(guān)系分析時，應根據(jù)材料ITS序列變異具體情況選擇合適的序列區(qū)間。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第二十九卷)[M].北京：科學出版社,2001:4-10.

[2]中國醫(yī)藥研究所.中藥志(第三卷)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1960:270-271.

[3]李金光,李嘉瑞.三葉木通果實生物學特性及營養(yǎng)成分的研究[J].廣西植物,1991,11(2):189-192.

[4]熊大勝,曹庸,朱金桃.人工栽培條件下三葉木通座果及果實生長特性研究[J].武漢植物學研究,1996,14(1):89-93.

[5]熊大勝,熊英,席在星,等.三葉木通豐產(chǎn)栽培技術(shù)研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2007,33(2):156-159.

[6]王瑛.三葉木通扦插繁殖技術(shù)研究[J].湖北林業(yè)科技,2006(6):25-28.

[7]Mimaki Y,Kuroda M,Yokosuka A.Triterpenes and triterpene saponins from the stems ofAkebiatrifoliate[J].Chem Pharm Bull,2003,51(8):960.

[8]關(guān)樹光,於文博,關(guān)樹宏.三葉木通中酚醇及酚醇苷類化學成分的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(4):905-907.

[9]李秀華,肖婭萍,謝嬌,等.三葉木通種質(zhì)資源形態(tài)多樣性研究[J].陜西師范大學學報(自然科學版),2007,35(4):88-93.

[10]Bellarosa R,Simeone M C,Papini A,etal.Utility of ITS sequence data for phylogenetic reconstruction of ItatlianQuercesspp.[J].Mol Phylogenet Evol,2005,34(2):355-370.

[11]Kress W J,Liu A Z,Newman M,etal.The molecular phylogeny ofAlpinia(zingiberaceac):a complex and polyphyletic genus of gingers[J].Am J Bot ,2005,92(1):167-178.

[12]Balasubramani S P,Murugan R,Ravikumar K,etal.Development of ITS sequence based molecular marker to distinguishTribulusterrestrisL.(Zygophyllaceae) from its adulterants[J].Fitoterapia,2010,81:503-508.

[13]黃紹輝.方炎明.改進的SDS-CTAB法提取瀕危植物連香樹總DNA[J].武漢植物學研究,2007,25(1):98-101.

[14]Kitaoka F,Kakiuchi N,Long C F,etal.Difference of ITS sequences ofAkebiaplants growing in various parts of Japan[J].J Nat Med,2009,63:368-374.

[15]Francisco-Ortega J,Santos-Guerra A,Hines A,etal.Molecular evidence for a Mediterranean orion of the Macaronesian endemic genusArgyranthemum(Asteraceae)[J].Am J Bot,1997,84(11):1595-1613.

[16]Campbell C S,Donoghue M J,Baldwin B G,etal.Phylogenetic relationships in Maloideae(Rosaceae):evidence from sequences of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA and ITS congruence with morphology[J].Am J Bot,1995，82:903-918.

[17]嚴寒靜,房志堅,余世孝,等.不同種源何首烏的ITS序列分析及其親緣關(guān)系研究[J].西北植物學報，2008,28(5):0922-0927.

[18]王潔,楊旭,楊志玲.不同產(chǎn)區(qū)厚樸nrDNA ITS 序列分析及親緣關(guān)系鑒定[J].廣西植物,2013,33(1):35-41.

[19]易駿,廖芳平,鄭偉文,等.不同種質(zhì)來源孩兒參的rDNA ITS區(qū)序列分析及鑒別[J].中草藥,2013,44(10):1318-1322.

[20]Sang T,Crawford D J,Stuessy T F,etal.Documentation of reticulae evolution inpeonies(Paeonia) using internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA:implications for biogeography and concerted evolution [J].Proc Natl Acad Sci USA,1995(92):6813-6817.

[21]Chase M W,Salamin N,Wilkinson M,etal.Land plants and DNA barcodes:short-term and long-term goal[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2005,360(1462):1889-1895.

[22]Chen S,Yao H,Han J.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS ONE,2010,5:e8613.

ITS Sequences Analysis and Genetic Relationship of Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.from Different Provenances

ZHOU Wen-cai，ZUO Ji-lin，ZHAN Zhi-yong，WANG Yu-juan，XING Wei-nian，GONG Chun

(Jiangxi Academy of Forestry,Nanchang Jiangxi 330013,P.R.China)

The rDNA ITS base sequences were measured and analyzed from 9 materials ofAkebiatrifoliata(Thunb.) Koidz., and genetic distance was analyzed and Neighbor-joining (NJ) tree was built. The results showed that the sequence length of each ITS of these 9 materials were 653 bp, and among which, that of ITS1 was 269 bp, and that of ITS2 was 221 bp.There were 7 variable sites (1.07%) in the whole ITS sequence.There were 4, 0, and 3 mutation sites in ITS1, 5.8S and ITS2, respectively, and these variable sites could be used as the informative sites for provenance identification. The genetic differentiation distance between sequences ranged from 0.002 to 0.008. The 9 materials can be classified as 2 clades according to their cluster dendrogram, which indicated the genetic relationship ofAkebiatrifoliata(Thunb.) Koidz. have certain relations to their geographical distribution.

Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.; ITS; genetic relationship; prowenances

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.05.010

2015-11-24

國家林業(yè)局2013年林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“木通科特色蓇葖果良種選育及高效栽培技術(shù)研究”(201304802)。

周文才(1978-)，男，助理研究員，博士，主要從事林木遺傳育種、經(jīng)濟林研究工作。

E-mail：zhouwencai2000@163.com

簡介：龔春(1975-)，女，研究員，碩士，主要從事經(jīng)濟林研究與開發(fā)利用工作。E-mail：gclhy@263.net

S 567;Q 943.2

A

1672-8246(2016)05-0054-04