任　榮，張　艷，芝　敏，張 蕾

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院腎病科,烏魯木齊　830011)

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高糖對腎小管上皮細胞泛素-核糖體蛋白52與TGF-β/Smad信號通路mRNA表達的影響

任榮，張艷，芝敏，張 蕾

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院腎病科,烏魯木齊830011)

目的探討高糖對腎小管上皮細胞泛素-核糖體蛋白(ubiquitin-ribosomal protein 52，UBA52)與TGF-β/Smad信號通路mRNA表達的影響及其UBA52在腎小管上皮細胞轉分化中的作用與可能機制。方法根據培養(yǎng)基葡萄糖濃度不同分成葡萄糖低濃度組(5.6 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖+甘露醇組(5.6 mmol/L葡萄糖+24.6 mmol/L甘露醇)、葡萄糖中濃度組(20 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖高濃度組(30 mmol/L葡萄糖)，分別干預48 h。觀察不同糖濃度對鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)形態(tài)的影響；實時熒光定量PCR檢測并比較不同葡萄糖濃度下UBA52、Smad7、轉化生長因子β1(TGF-β1)與α-SMA mRNA水平。結果高糖可致NRK-52E向成纖維細胞轉分化；葡萄糖低濃度組、葡萄糖+甘露醇組、葡萄糖中濃度組、葡萄糖高濃度組腎小管上皮細胞UBA52 mRNA的表達分別為( 1.002±0.075)、(0.092±0.083)、(1.994±0.146)、(2.160±0.210)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TGF-β1的表達分別為(1.003±0.089)、(1.180±0.060)、(1.214±0.169)、(2.158±0.266)，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；Smad7mRNA表達分別為(1.002±0.078)、(1.106±0.049)、(0.952±0.044)、(0.332±0.110)，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；α-SMA mRNA表達分別為(1.002±0.007)、(1.046±0.091)、(1.720±0.032)、(2.885±0.254)，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；伴隨著葡萄糖濃度的升高，UBA52、TGF-β1、α-SMA mRNA表達逐漸增加，而Smad7 mRNA的表達逐漸下降。UBA52與TGF-β1 mRNA表達量呈正相關(r=0.58，P<0.05)，與 Smad7mRNA表達量呈負相關(r=-0.61，P<0.05)。結論腎小管上皮細胞泛素前體UBA52、TGF-β1、α-SMA mRNA表達呈葡萄糖濃度依賴性增加，而Smad7基因表達呈葡萄糖濃度依賴性下降，UBA52可能參與了高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞TGF-β/Smad信號通路的調控，實現(xiàn)腎小管上皮細胞轉分化。

糖尿病腎病；泛素-核糖體蛋白52(UBA52)；Smad7；腎小管上皮細胞轉分化

糖尿病腎病中，Smad7通過泛素蛋白酶體途徑被泛素化降解，從而使轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)被持續(xù)激活是腎小管上皮細胞轉分化的原因之一，而泛素蛋白酶體抑制劑MG132可改善高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞纖維化[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠及糖尿病腎病患者血液及尿液中泛素的前體泛素-核糖體蛋白52( ubiquitin-ribosomal protein 52，UBA52)大量表達[3]，但其是否參與及如何參與糖尿病腎病的發(fā)病機制，目前研究較少。本實驗擬通過觀察不同糖濃度對UBA52及TGFβ1/Smad7mRNA表達的影響，探討腎小管上皮細胞轉分化過程中UBA52與TGFβ1/Smad7的關系。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器大鼠腎小管上皮細胞NRK52E(中國科學院上海細胞庫提供)，DMEM低糖培養(yǎng)基(Life technologies公司，美國)，胎牛血清(Life technologies公司，美國)，青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)(Hyclone公司，美國)，Trizol(美國 MRC)，反轉錄試劑盒，SYBR Select Master Mix(ABI公司，美國)。CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司 Smart Cell HF-90)，熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司 Eclipse TS100-F)，PCR 擴增儀(美國Thermo公司),凝膠成像系統(tǒng)(中國上海天能科技有限公司)。

1.2細胞分組及處理用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(5.6 mmol/L)培養(yǎng) NRK52E細胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2孵育箱，待細胞生長達到80%時使用無胎牛血清的 DM EM 培養(yǎng)液處理細胞24 h，使細胞生長同步化。24 h后棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度葡萄糖完全培養(yǎng)基。實驗分為4組，分別為葡萄糖低濃度組(5.6 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖+甘露醇組(5.6 mmol/L葡萄糖+24.6 mmol/L甘露醇)、葡萄糖中濃度組(20 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖高濃度組(30 mmol/L葡萄糖)，每組5個重復，置于37℃培養(yǎng)48 h。

1.3RNA抽提及RT-PCR用 Trizol 分別提取各組細胞的總RNA，RNA 樣本溶于DEPC水中，測260/280 A比值，計算RNA得率，調整RNA濃度。將提取的總RNA反轉錄為cDNA，步驟如下：RNA模板2.5 μg，Oligo d T 1 μL，DEPC水補足至11 μL，70℃水浴5 min，立即冰浴，5×buffer 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，d NTP 2 μL，DEPC水1.5 μL，37℃水浴5 min，加入反轉錄酶1 μL，42℃水浴1 h，70℃滅活10 min。

用SYBR Green 染料檢測細胞目的基因的表達情況，并將β-actin作為內參照，引物序列見表1。PCR反應體系為：PCR mix 10 μL、primer F 0.4 μL、primer R 0.4 μL、CDNA 1.0 μL、ddH2O 8.2 μL，總反應體積為20 μL。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min預變性后，95℃ 15 s，60℃ 60 s 共進行40個循環(huán)。采用相對定量公式:2-△△Ct,[△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，△△Ct=△Ct (實驗樣本)-△Ct (對照樣本)]，計算細胞目的基因的相對表達量。

表1　引物序列

2　結果

2.1高糖對NRK52E形態(tài)的影響葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組部分腎小管上皮細胞呈梭形或星形，并有廣泛的偽足形成，呈現(xiàn)出肌成纖維細胞特征(如圖1所示)。提示高糖條件下，腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉分化。

圖1高糖下腎小管上皮細胞形態(tài)學改變(×200)

2.2高糖對NRK52E 中UBA52的表達及TGF/samd信號通路mRNA的影響葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組腎小管上皮細胞表達UBA52 mRNA較葡萄糖低濃度組及葡萄糖+甘露醇組明顯增多(P<0.05)；兩兩比較的結果:葡萄糖高濃度組比葡萄糖中濃度組腎小管上皮細胞UBA52 mRNA表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；葡萄糖低濃度組與葡萄糖+甘露醇組腎小管上皮細胞UBA52 mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，提示UBA52基因表達增加呈葡萄糖濃度依賴性，滲透壓增加不影響UBA52基因表達。葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組腎小管上皮細胞表達Smad7 mRNA較葡萄糖低濃度組及葡萄糖+甘露醇組明顯減少(P<0.05)；兩兩比較的結果顯示葡萄糖高濃度從低濃度、中濃度組到高濃度組腎小管上皮細胞Smad7 mRNA表達逐步減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；葡萄糖低濃度組與葡萄糖+甘露醇組腎小管上皮細胞Smad7 mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。葡萄糖中濃度組及葡萄糖高濃度組腎小管上皮細胞表達TGF-β1及α-SMA mRNA較葡萄糖低濃度組及葡萄糖+甘露醇組明顯增加(P<0.05)；兩兩比較的結果顯示葡萄糖濃度從低濃度組、中濃度組到高濃度組腎小管上皮細胞TGF-β1及α-SMA mRNA表達逐步增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；葡萄糖低濃度組與葡萄糖+甘露醇組腎小管上皮細胞TGF-β1及α-SMA mRNA表達無明顯差異(P>0.05),提示伴隨著葡萄糖濃度的增加，UBA52、TGF-β1及α-SMA mRNA表達逐步增多，而Smad7表達逐步減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但滲透壓增加不能改變腎小管上皮細胞對UBA52、Smad7、TGF-β1及α-SMA的基因表達(表2)。

表2　不同葡萄糖濃度對NRK52E轉分化相關指標mRNA表達的影響

注：與葡萄糖低濃度組比較，*P<0.05；與葡萄糖+甘露醇組比較，▲P<0.05；與葡萄糖中濃度組比較，▽P<0.05。

2.3UBA52與TGF-β/Smad信號通路的相關性分析對各組NRK52E 細胞中UBA52 mRNA與 TGF-β1 和Smad7 mRNA的表達量進行相關性分析，結果顯示，UBA52 mRNA與TGF-β1 表達呈正相關(r=0.58，P<0.05)；UBA52與 Smad7表達呈負相關(r=-0.61，P<0.05)。

3　討論

我國目前糖尿病患病率已達到11.6%，而其中約34.7%的患者并發(fā)不同程度的糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)[4]。糖尿病腎病是終末期腎功能衰竭的主要原因之一[5]，其主要的病理改變?yōu)槟I小球硬化和腎間質纖維化。腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞是糖尿病腎病腎間質纖維化發(fā)生機制之一，其最主要的組織學特征是腎小管的萎縮和細胞外基質的沉積，轉分化的肌成纖維細胞分泌的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是細胞外基質的主要組成成分[6]。本實驗的結果也證實,葡萄糖中濃度組及高濃度組的腎小管上皮細胞的確在形態(tài)學上出現(xiàn)了肌成纖維細胞的特點，且其α-SMA表達明顯高于葡萄糖低濃度組，均說明高糖促使腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞。

TGF-β/Smad信號通路是腎小管上皮細胞轉分化及腎間質纖維化的經典通路。而該信號通路中的信號轉導分子Smad7屬于負調控因子，可與TGF-β受體識別、牢固結合，介導TGF-β受體泛素化降解，抑制TGF-β1/Smad信號通路活性，其表達的上調，有助于防止腎小管向肌成纖維細胞轉分化[7-8]。近年來許多研究證實，高糖可通過調節(jié)泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway，UPP)的活性，激活TGF-β/Smad信號通路，并且抑制Smad7的表達，這可能與TGF-β1介導 E3 泛素連接酶 Smad泛素化調節(jié)因子2(Smad ubiquitin adjustment factor 2，Smurf2)，特異性泛素化降解 Smad7 有關[2]。

UPP途徑的活性與泛素池內游離泛素數(shù)目有關。UBA52是一種泛素的前體，主要在腎小管上皮細胞表達，由1個泛素及52 個氨基酸殘基(核糖體蛋白L40)組成，經過去泛素化酶水解后可釋放游離泛素。以往研究表明，糖尿病腎病動物模型及患者血及尿中UBA52表達增加[9-11]，可能參與糖尿病腎病形成的機制，但其如何參與了糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不明確。基因研究發(fā)現(xiàn)，其基因上游啟動子區(qū)域存在E-box序列，高糖可與之結合后，啟動UBA52大量表達[11]。本研究的結果表明,中、高葡萄糖濃度組腎小管上皮細胞中UBA52基因的表達較正常葡萄糖濃度組明顯增加，且呈葡萄糖濃度依賴性,也支持上述結論。

本實驗結果也表明高糖可抑制Smad7基因表達，上調TGF-β1、α-SMA基因表達，而上述基因表達的變化似乎與UBA52的表達呈現(xiàn)一定的相關性。進一步的相關性分析顯示UBA52 mRNA表達與Smad7 mRNA表達呈負相關，與TGF-β1mRNA表達呈正相關，提示UBA52可能參與了TGF-β/Smad信號通路的調節(jié)，對TGF-β1及Smad7基因表達進行調控，而其發(fā)揮作用的機制可能是通過為UPP途徑提供泛素，最終導致Smad7被泛素化降解。因此，推測糖尿病腎病情況下，高糖通過刺激腎小管上皮細胞大量表達UBA52，持續(xù)活化TGF-β/Smad信號通路，導致腎小管上皮細胞轉分化，促進腎小管間質纖維化的發(fā)生，參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。但這一結論還需通過觀察UBA52的沉默或過表達對TGF-β/Smad信號通路的作用進一步證實。

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(本文編輯楊晨晨)

Effect of high glucose on expression of UBA52 mRNA and TGF-β/Smad Signaling pathway in Renal Tubular Cell

REN Rong,ZHANG Yan,ZHI Min,ZHANG Lei

(Department of Renal Disease,the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo explore the effect of high glucose on expression of UBA52 and TGF-β/Smad Signaling pathway in renal tubular cell.MethodsThe rat renal tubular epithelial cells (NRK52E) were cultured in vitro and divided into 4 groups based on its glucose concentration,which were group A (5.6 mmol/L glucose),group B (5.6 mmol/L glucose+24.6 mmol/L mannitol),group C (20.0 mmol/L glucose) and group D (30.0 mmol/L glucose),then cells of each group were cultured in different media for another 48 hours.Cells morphology of each group were observed.Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect UBA52,Smad7,TGF-β1,and α-SMA mRNA expression.ResultsHigh glucose can lead renal tubular epithelial cells to transdifferentiate into fibroblast.the mRNA expression of UBA52,TGF-β1,and α-SMA increased depending on glucose concentration,while the expression of Smad7 mRNA decreased.UBA52 mRNA was positively correlated with TGF-β1 (P<0.05) and negatively with Smad7 expression (P<0.05).ConclusionsUBA52 may be participated into the pathogenesis of diabetic nephropathy by activating on TGF-β/Smad pathway.

Diabetic nephropathy; UBA52; Smad7; Tubular epithelial trans-differentiation

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2014211C127)

任榮(1978-),女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腎臟病臨床與基礎。

芝敏，女，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，研究方向：腎臟病臨床與基礎，E-mail：627659081@qq.com。

S941.42+7

A

1009-5551(2016)11-1424-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.019

2016-06-05]