楊偉麗 劉肖瑩 于 輝 王廣天 李明慧 彭海生

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶163319

AMO-1脂質(zhì)體對(duì)缺血性心律失常大鼠的治療研究

楊偉麗 劉肖瑩 于 輝 王廣天 李明慧 彭海生

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶163319

目的為治療大鼠缺血性心律失常，構(gòu)建抗體修飾的脂質(zhì)體，遞送AMO-1到缺血心肌。方法采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，并分析脂質(zhì)體的粒徑、電位、包封率和釋放率，用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取，小動(dòng)物活體成像評(píng)價(jià)脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的靶向性，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)確定給藥濃度，采用心電圖評(píng)價(jià)cT-A-LIP抗心律失常作用。結(jié)果脂質(zhì)體的粒徑均小于120 nm，電位大于-3.8 mV，包封率為（63.0±5.7）%，24 h累積釋放率為（32.6±0.7）%。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞對(duì)A-LIP、cT-A-LIP都有一定的攝取率，但有一定差異。小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，cT-A-LIP組藥物靶向心臟缺血部位。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂質(zhì)體中0.5 μmol/L的AMO-1濃度是cT-A-LIP和A-LIP的最大有效安全劑量。心電圖結(jié)果顯示，給藥24 h后ST段明顯下降并接近于正常水平。結(jié)論抗cTnI抗體修飾AMO-1脂質(zhì)體能夠靶向到大鼠的缺血心肌，并且能夠緩解缺血性心率失常。

缺血性心律失常；脂質(zhì)體；AMO-1；抗cTnI抗體

心肌梗死引起的缺血性心律失常是危害人類健康的重要疾病之一，具有較高的死亡率，然而傳統(tǒng)的藥物對(duì)缺血性心律失常的治療效果并不明顯［1-2］。2007年Yang等［3］發(fā)現(xiàn)miR-1是治療缺血性心律失常的靶點(diǎn)。當(dāng)心臟中miR-1表達(dá)上調(diào)時(shí)心律失常的發(fā)生率增加，而將miR-1特異性反義寡核苷酸（AMO-1）局部導(dǎo)入缺血心肌時(shí)，心律失常的發(fā)生率明顯降低［4］。

在納米載體中脂質(zhì)體因具有良好的細(xì)胞親和性、靶向性、緩釋性和可以提高藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，成為最有前景的基因藥物載體［5-7］。因此，本研究選用脂質(zhì)體作為藥物的載體。心肌肌鈣蛋白（cTnI）作為一種特異性心肌標(biāo)志物，是心肌損傷的標(biāo)志蛋白，具有高度特異性和敏感性，是臨床上早期判斷心肌梗死的重要依據(jù)［8-10］。心肌缺血患者心肌間質(zhì)4～48 h cTnI濃度高于正常，這種缺血性心肌cTnI的特異性高表達(dá)為本研究提供了構(gòu)建靶向制劑的特異靶點(diǎn)［11-13］。本研究通過單克隆抗體技術(shù)制備心肌特異性抗cTnI單克隆抗體，再將該抗體共價(jià)偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面，利用抗體介導(dǎo)將載藥脂質(zhì)體富集到病理心肌組織中，以實(shí)現(xiàn)抗體介導(dǎo)靶向缺血心肌、治療缺血性心律失常的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器蛋黃卵磷脂（日本NOF公司）；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000）（日本NOF公司）；DSPE-PEG-MAL（上海西寶生物科技有限公司）；羅丹明（北京海德生物技術(shù)有限公司）；DiR染料（北京海德生物技術(shù)有限公司）；miR-1的反義抑制劑AMO-1（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；抗cTnI抗體（京博奧森生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇分析純級(jí)（北京海德生物技術(shù)有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Millipore公司）；BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；小動(dòng)物活體成像（美國(guó)Carestream Health公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年Wistar大鼠，體重220～250 g，清潔級(jí)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)（大慶）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為A-LIP組和cT-A-LIP組，每組6只。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)體的制備（A-LIP、cT-A-LIP）稱取膽固醇、卵磷脂和DSPE-PEG2000適量，根據(jù)需要加入羅丹明或者DiR染料，加入AMO-1，用薄膜分散法制備脂質(zhì)體［14］。稱取DSPE-PEG-MAL 9 mg溶于1 mL HEPES溶液中，再量取cTnI抗體80 μL（2 mg/mL）溶于1 mL HEPES溶液中，之后將兩者混合孵育12 h［15］，即得到DSPE-PEG-MAL-cTnI抗體連接物。將抗體連接物溶液和等量的脂質(zhì)體溶液混合，37℃孵育，生理鹽水透析，得到抗cTnI抗體修飾的脂質(zhì)體溶液（cTnIA-LIP）。

1.2.2 脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位檢測(cè)將脂質(zhì)體溶液進(jìn)行稀釋，再以激光粒徑測(cè)定儀分別檢測(cè)脂質(zhì)體溶液的平均粒徑和Zeta電位。

1.2.3 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定分別制備載AMO-1脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體，并取AMO-1脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體各1 mL，離心，取上清液，以空白脂質(zhì)體的上清液為對(duì)照，利用紫外-可見分光光度計(jì)在548 nm處檢測(cè)AMO-1的吸光度，并繪制AMO-1在548 nm處的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線，以空白脂質(zhì)體的上清液為對(duì)照，在線性范圍內(nèi)檢測(cè)AMO-1脂質(zhì)體上清液的吸光度，并根據(jù)AMO-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出脂質(zhì)體上清液中AMO-1的濃度。根據(jù)公式包封率（%）=（AMO-1總的加入量-上清液中AMO-1的量）/AMO-1總加入量×100%，求算載藥脂質(zhì)體中AMO-1的包封率。

1.2.4 脂質(zhì)體的體外釋放實(shí)驗(yàn)制備A-LIP和cT-ALIP各0.5 mL，分別檢測(cè)其釋放率。取0.5 mL脂質(zhì)體溶液于透析袋中，將其放于100 mL用DEPC水處理過的PBS透析液中，分別在透析后1、2、4、6、18、24 h時(shí)取2 mL透析液，于548 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，同時(shí)每次向透析液中補(bǔ)充2 mL新鮮的PBS緩沖液。最后將透析袋中的脂質(zhì)體全部溶于透析液中，此時(shí)的藥物濃度為完全釋放時(shí)的藥物濃度［16］。藥物的釋放量（%）=各時(shí)間點(diǎn)透析液中藥物的濃度×100/未透析時(shí)脂質(zhì)體中藥物的濃度×0.5×100%。

1.2.5 脂質(zhì)體的攝取研究分別制備用羅丹明標(biāo)記的A-LIP和cT-A-LIP備用。將剛分離出的原代心肌細(xì)胞懸液鋪于6孔板中，分別向每孔中加入等量的cTA-LIP、A-LIP、PBS緩沖溶液。孵育后用胰酶消化液消化，再用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，放于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.6 心肌靶向性研究將大鼠心臟的冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎，造成心肌梗死模型。用10%水合氯醛麻醉后分別通過尾靜脈注射等量的DiR染料標(biāo)記的cTA-LIP和A-LIP。再將大鼠放于活體成像動(dòng)物倉(cāng)中拍攝，各實(shí)驗(yàn)組分別于給藥后1、6 h拍攝。

1.2.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn)將原代心肌細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為2×104個(gè)。用DMEM培養(yǎng)液將制備的載藥脂質(zhì)體溶液進(jìn)行稀釋，藥物濃度分別為8、2、0.5、0.125 μmol/L。每個(gè)濃度的載藥脂質(zhì)體取10 μL加入96孔板的6個(gè)孔中，空白對(duì)照組加10 μL DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 h后在每孔中加入10 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔中加100 μL二甲基亞砜，置于搖床上振搖10 min，將96孔板放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于492 nm處檢測(cè)各孔的吸光度。將空白對(duì)照組設(shè)為100%，相對(duì)細(xì)胞活性（%）=實(shí)驗(yàn)組的吸光度/空白對(duì)照組的吸光度×100%。

1.2.8 心電圖檢測(cè)先檢測(cè)正常大鼠的心電圖，再檢測(cè)心肌梗死的大鼠的心電圖，并將心肌梗死3 d的大鼠尾靜脈注射cT-A-LIP，24h后麻醉大鼠，連接心電圖掃描儀，插上心電圖電極，記錄給藥后24 h大鼠心電圖的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 制備脂質(zhì)體的特性

結(jié)果顯示，所有制備的脂質(zhì)體粒徑均＜120 nm，Zeta電位＞-3.8 mV。制備的A-LIP和cT-A-LIP中AMO-1的包封率均＞60.0%，24 h累積釋放率＞27.0%。見表1、圖1。

表1 脂質(zhì)體的特征（n=3）

圖1 制備的cT-A-LIP脂質(zhì)體特征

2.2 流式檢測(cè)

流式結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞對(duì)羅丹明標(biāo)記的A-LIP和cT-A-LIP的熒光吸收值分別為237、253，而空白對(duì)照組的熒光吸收值為133。說明心肌細(xì)胞對(duì)A-LIP和cT-A-LIP有一定的攝取。見圖2（封三）。

2.3 心肌靶向性研究

用小動(dòng)物活體成像檢測(cè)藥物在心肌梗死大鼠體內(nèi)的靶向性。cT-A-LIP組心臟處的熒光明顯高于ALIP組，說明藥物靶向到了心臟，并且在6 h時(shí)熒光強(qiáng)度最大。見表2、圖3（封三）。

表2 兩組大鼠心臟中熒光強(qiáng)度情況（n=6）

2.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

分別檢測(cè)AMO-1濃度為0.125、0.5、2.0、8.0 μmol/L的cT-A-LIP和A-LIP的細(xì)胞活性，以未加藥的細(xì)胞活性為空白對(duì)照組（其活性設(shè)置為100%）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物濃度低于0.5 μmol/L時(shí)cT-A-LIP和ALIP對(duì)細(xì)胞都沒有明顯毒性，而當(dāng)濃度高于2 μmol/L時(shí)cT-A-LIP和A-LIP對(duì)心肌細(xì)胞有明顯的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂質(zhì)體中0.5 μmol/L的AMO-1濃度是cT-A-LIP和A-LIP的最大有效安全劑量。見圖4。

圖4 脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性情況（n=3）

2.5 心電圖檢測(cè)結(jié)果

大鼠經(jīng)冠脈結(jié)扎后（MI組）心電圖顯示，ST段較未結(jié)扎前（BLANK組）明顯抬高，說明大鼠心肌梗死模型已成功建立。尾靜脈注射cT-A-LIP（AMO-1濃度是0.5 μmol/L）24 h后，ST段明顯下降并接近于正常水平。見圖5。

圖5 三組心電圖掃描結(jié)果（n=3）

3 討論

心律失常會(huì)導(dǎo)致心肌缺血，使心肌細(xì)胞處在缺氧的環(huán)境中，從而引起心肌細(xì)胞的不可逆性死亡。常規(guī)的藥物治療缺乏組織特異性，從而難以使藥物直達(dá)病灶。在大鼠體內(nèi)miR-1主要表達(dá)在心臟和骨骼肌中，而當(dāng)心肌缺血發(fā)生時(shí)，miR-1在大鼠心肌中存在過表達(dá)現(xiàn)象［17］。而miR-1的過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致缺血性心律失常的發(fā)生，當(dāng)反義核苷酸AMO-1局部導(dǎo)入缺血的心肌時(shí)，心律失常的發(fā)生率明顯降低［18-19］?？紤]到AMO-1的穩(wěn)定問題，需要一種給藥系統(tǒng)能提高藥物在血液中的穩(wěn)定性并且能夠靶向到缺血的心肌中從而降低miR-1的表達(dá)水平，同時(shí)減小藥物對(duì)其他正常組織的影響［20］。因此，本研究設(shè)計(jì)抗cTnI抗體修飾在脂質(zhì)體表面，通過抗體與抗原的特異性結(jié)合使得藥物能夠靶向到缺血的心肌。

所制備的脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位都在納米系統(tǒng)的范圍內(nèi)，說明制備的脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。從流式細(xì)胞儀的結(jié)果看出心肌細(xì)胞對(duì)A-LIP和cTA-LIP的攝取均高于空白對(duì)照組。小動(dòng)物活體成像的結(jié)果直觀顯示了抗cTnI抗體修飾脂質(zhì)體濃集在缺血的心臟中。冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后的大鼠經(jīng)尾靜脈注射給予cT-A-LIP后，用心電圖掃描，掃描結(jié)果顯示心肌梗死大鼠經(jīng)cT-A-LIP治療24 h后ST段有所下降（心肌梗死后大鼠ST段明顯抬高），直接說明了cT-A-LIP對(duì)大鼠缺血性心律失常的療效。

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Study of liposomes loaded with AMO-1 for arrhythmia therapy in rats

YANG WeiliLIU XiaoyingYU HuiWANG GuangtianLI MinghuiPENG Haisheng
College of Pharmacy，Daqing Campus，Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Daqing163319，China

Objective To construct an antibody modified liposome to deliver AMO-1 to ischemic myocardium for arrhythmia therapy in rats.Methods The liposomes were prepared by the thin film hydration process.The particle size，zeta potential，encapsulation efficiency and release rate of liposomes were analyzed.The uptake of liposomes by primary myocardial cells was evaluation by flow cytometry.The targeting distribution of liposomes was monitored by the in vivo imaging.The concentration of the drug was determined by the cytotoxicity test.The anti-arrhythmic effects of cT-ALIP were evaluated by electrocardiograms（ECG）.Results The size of liposomes was less than 120 nm，the potential was higher than-3.8 mV，the encapsulation efficiency was（63.0±5.7）%，and the cumulative release rate after 24 hours was（32.6±0.7）%.The results of flow cytometry showed that cT-A-LIP and A-LIP were internalized by primary myocardial cells to some extent，and there were significant differences.The data from the in vivo imaging showed that the drug was accumulated to the foci in the heart.The results of cell toxicity test showed that 0.5 μmol/L AMO-1 concentration in the liposome was the largest safe and effective dose of cT-A-LIP and A-LIP.ECG results showed that the ST segment was obviously decreased and close to the normal level at 24 hours after drug administration.Conclusion The liposomes modified with anti-cTnI antibody as AMO-1 carriers are able to target ischemic myocardium in rats and relieve ischemic arrhythmias.

Ischemic arrhythmias；Liposomes；AMO-1；Anti-cTnI antibody

R943

A

1673-7210（2016）07（b）-0008-04

2016-04-10本文編輯：程銘）

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2012C031）。

楊偉麗（1976.12-），女，碩士；研究方向：緩控釋靶向給藥系統(tǒng)。

彭海生（1975.11-），男，博士，教授；研究方向：納米給藥系統(tǒng)。