寧　　娜，韓建軍，胡宇莉，鄒宗堯，郁建生

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120；4.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 北培 400715）

酶法輔助回流提取荷葉中荷葉堿的工藝研究

寧娜1，2，韓建軍1，2，胡宇莉3，4，鄒宗堯4，郁建生1，2

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120；4.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 北培 400715）

為了優(yōu)化纖維素酶輔助乙醇回流提取荷葉中荷葉堿的工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了提取荷葉堿過(guò)程中的酶解pH值、酶解溫度、纖維素酶用量及酶解時(shí)間對(duì)荷葉堿提取率的影響，得出優(yōu)化的酶解輔助提取工藝為：酶解pH值4.5、酶解溫度45℃、纖維素酶用量1.5 mg/g、酶解時(shí)間50 min，在此條件下荷葉堿提取率達(dá)到0.536%。該提取工藝合理、穩(wěn)定、可行，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

荷葉；荷葉堿；纖維素酶；回流；提取

荷葉為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥葉，其性苦味平，具有消暑化濕、涼血止血之功效，主治暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、子宮出血等癥［1］。荷葉含有生物堿、黃酮、甾醇等成分，其中荷葉堿是荷葉藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分［1-2］。

目前已報(bào)道的荷葉中荷葉堿的提取主要有回流法［3］、浸提法［4］、超高壓［5］等。生物酶解技術(shù)是一種新興的提取方法，該方法是通過(guò)生物酶的酶解作用可使植物細(xì)胞壁疏松、破裂，促進(jìn)有效成分的溶出，具有收率高、反應(yīng)條件溫和且易于控制等特點(diǎn)［6-7］。因此，越來(lái)越多的研究將生物酶解技術(shù)與回流法聯(lián)合起來(lái)應(yīng)用于植物有效成分的提取中，具有提取率高、提取時(shí)間短、有機(jī)溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)［8-9］。目前將生物酶解技術(shù)聯(lián)合回流法應(yīng)用于荷葉中荷葉堿的提取尚未見(jiàn)報(bào)道。本文在常規(guī)回流法提取荷葉中荷葉堿的基礎(chǔ)上加入酶解預(yù)處理步驟，并通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解輔助提取工藝，為荷葉中荷葉堿的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；pHS-3C精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；水為重蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；纖維素酶（酶活力：22 000 U/g）（寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司）；荷葉堿對(duì)照品（純度：99.9%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.2藥材荷葉，產(chǎn)地為江西，購(gòu)自江西樟樹(shù)中藥材市場(chǎng)，由本院梁玉勇教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1荷葉堿的HPLC測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》［1］，具體色譜條件為：Kromasil-C18柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數(shù)以荷葉堿峰計(jì)算不低于2 000。該色譜條件下測(cè)定荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品及荷葉藥材得到的色譜圖見(jiàn)圖1。峰面積Y與荷葉堿濃度X（μg/mL）之間的回歸方程為：Y= 513496.20X+89844.46，R=0.9997，線性范圍為：5.4～172.8 μg/mL。經(jīng)測(cè)定，本試驗(yàn)所用荷葉藥材中荷葉堿含量為0.563%。

1.3.2荷葉中荷葉堿的提取工藝流程酶法輔助乙醇回流提取荷葉中荷葉堿的提取工藝流程如下：荷葉→干燥、粉碎成粗粉（過(guò)40目篩）→纖維素酶解→回流提取→合并提取液→減壓回收溶劑→浸膏→真空干燥→測(cè)定荷葉堿含量，并計(jì)算荷葉堿收率。通過(guò)參考文獻(xiàn)［10］及結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定回流提取荷葉堿的工藝條件為：用8倍量的60%乙醇提取2次，每次60 min。

圖1　荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品（A）和荷葉藥材（B）的高效液相色譜圖

1.3.3荷葉堿提取率的計(jì)算取0.3 g荷葉乙醇浸膏置于10 mL容量瓶中，并用甲醇超聲溶解后，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算荷葉堿含量，并計(jì)算荷葉堿提取率。荷葉堿提取率按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

荷葉堿提取率（%）=［提取得到的荷葉堿量（g）/荷葉藥材中荷葉堿含量（g）］×100%。

1.3.4酶輔助回流提取的單素試驗(yàn)分別選取酶解pH值、酶解溫度、纖維素酶用量和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)中，除所考察的因素外，其他參數(shù)分別為：酶解pH值4.5、酶解溫度45℃、纖維素酶用量1.5 mg/g、酶解時(shí)間40 min。

1.3.5酶輔助回流提取的正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正式試驗(yàn)的因素及水平。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1酶解pH值稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，酶解pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，按照1.3.2提取荷葉堿，并計(jì)算荷葉堿提取率。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　酶解pH值對(duì)荷葉堿提取率的影響

由圖2可知，荷葉堿提取率隨著酶解pH值的增大而增大，在酶解pH值為4.5時(shí)達(dá)到最大，隨著酶解pH值進(jìn)一步增大，荷葉堿提取率有下降趨勢(shì)，這是由于酶解pH值高于或低于纖維素酶的最適pH值均會(huì)影響纖維素酶的催化活力，從而影響荷葉堿的提取效率。因此選擇4.0、4.5、5.0作為正交試驗(yàn)中酶解pH值因素的3個(gè)試驗(yàn)水平。

2.1.2酶解溫度稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，酶解溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，按照1.3.2提取荷葉堿，并計(jì)算荷葉堿提取率。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　酶解溫度對(duì)荷葉堿提取率的影響

由圖3可知，荷葉堿提取率隨著酶解溫度的升高而增大，在酶解溫度為45℃時(shí)達(dá)到最大，隨著酶解溫度進(jìn)一步升高，荷葉堿提取率有下降趨勢(shì)，這是由于低于纖維素酶的最適溫度時(shí)，溫度升高可促進(jìn)纖維素酶酶活力的增強(qiáng)，而高于纖維素酶的最適溫度時(shí)可引起酶蛋白的變性，從而降低纖維素酶的催化活力。因此選擇40℃、45℃、50℃作為正交試驗(yàn)中酶解溫度因素的3個(gè)試驗(yàn)水平。

2.1.3纖維素酶用量稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，纖維素酶用量分別為0.5 mg/g、1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g、2.5 mg/g，按照1.3.2提取荷葉堿，并計(jì)算荷葉堿提取率。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　纖維素酶用量對(duì)荷葉堿提取率的影響

由圖4可知，荷葉堿提取率隨著纖維素酶用量的增加而增大，在纖維素酶用量為1.5 mg/g時(shí)達(dá)到最大，隨著纖維素酶用量進(jìn)一步增加，荷葉堿提取率有下降趨勢(shì)。這是由于隨著纖維素酶用量的增加，促進(jìn)了纖維素酶對(duì)荷葉藥材植物細(xì)胞壁的降解，增加了荷葉堿的溶出，當(dāng)酶用量超過(guò)1.5 mg/g之后，酶與底物的作用點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到飽和，繼續(xù)增加纖維素酶用量，使纖維素酶過(guò)于擁擠而包裹住荷葉藥材顆粒，從而阻礙荷葉堿的溶出。因此選擇1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g作為正交試驗(yàn)中纖維素酶用量因素的3個(gè)試驗(yàn)水平。

2.1.4酶解時(shí)間稱取荷葉堿粉末5份（10 g），加入100 mL蒸餾水，酶解時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min，按照1.3.2提取荷葉堿，并計(jì)算荷葉堿提取率。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　　酶解時(shí)間對(duì)荷葉堿提取率的影響

由圖5可知，荷葉堿提取率隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而明顯升高，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)40 min后，荷葉堿提取率增加的趨勢(shì)有所平緩。因此選擇30 min、40 min、50 min作為正交試驗(yàn)中酶解時(shí)間因素的3個(gè)試驗(yàn)水平。

2.2正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以荷葉堿提取率為指標(biāo)，選擇酶解pH值、酶解溫度、纖維素酶用量、酶解時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)荷葉堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平和試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

表1　因素與水平

由表2的極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)荷葉堿提取率影響的順序?yàn)椋好附鈖H值＞酶解溫度＞纖維素酶用量＞酶解時(shí)間。優(yōu)化得到的酶解輔助提取條件為A2B2C2D3，即酶解pH值為4.5、酶解溫度為45℃、纖維素酶用量為1.5 mg/g、酶解時(shí)間為50 min。在此條件下，荷葉堿的提取率為0.536%。

3　結(jié)論

本研究采用酶法輔助回流法提取荷葉中荷葉堿，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，最終確定最佳酶解輔助提取條件為：酶解pH值為4.5、酶解溫度為45℃、纖維素酶用量為1.5 mg/g、酶解時(shí)間為50min。荷葉藥材在該條件下酶解后，再進(jìn)行常規(guī)回流提取（用8倍量60%乙醇提取2次，每次提取60 min），荷葉堿的提取率可達(dá)0.536%。優(yōu)化的工藝穩(wěn)定可行，較常規(guī)乙醇回流提取法［10-11］的提取效率高、提取時(shí)間短、有機(jī)溶劑消耗量少。該提取方法對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求、試驗(yàn)條件容易控制、溶劑消耗量少、安全環(huán)保，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

表2　正交試驗(yàn)表及結(jié)果

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典（二部）［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：380.

［2］趙小亮，王智民，馬小軍，等.荷葉化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（5）：703-708.

［3］王玉霞，劉斌，姜艷艷.荷葉生物堿提取純化工藝研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（9）：622-626.

［4］朱曉月，劉虹，郝彧，等.荷葉中生物堿提取及純化工藝研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（9）：22-24.

［5］Liu F，Zhu R H，Lin X J，et al.Cloud point extraction and preconcentration of four alkaloids in Nelumbo nucifera leaves by ultrahigh pressure-assisted extraction［J］.Separation Science and Technology，2014，49（7）：981-987.

［6］王賽君，伍振峰，楊明，等.中藥提取新技術(shù)及其在國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2014，39（8）：1360-1367.

［7］宋成英.酶解技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（8）：1934-1935.

［8］李會(huì)端.酶解法提取紫藤總黃酮及自由基清除活性研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，42（3）：79-84.

［9］吳衛(wèi)，唐振祥，李素珍.酶解法輔助提取鉤藤中鉤藤堿的工藝優(yōu)選［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（10）：23-25.

［10］王國(guó)華，張保獻(xiàn)，聶其霞，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選荷葉中荷葉堿與荷葉黃酮的提取工藝［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（20）：2332-2335.

［11］王玉霞，劉斌，姜艷艷.荷葉生物堿提取純化工藝研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（9）：622-626.

Study on Enzyme-Assited Reflux Extraction for NuciferinefromNelumbo nuciferaLeaves

NING Na1，2，HAN Jian-jun1，2，HU Yu-li3，4，ZOU Zong-yao4，YU Jian-sheng1，2
（1.Department of Phamrmacy，Tongren Vocational and Technical College，Tongren 554300，China；2.Engineering Reserch Center of Vetrinary Traditonal Chinese Medicine in Guizhou，Tongren 554300，China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Chongqing，Chongqing 401120，China；4.School of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Nuciferine was extracted from Nelumbo nucifera leaves by cellulase-assited ethanol reflux extraction method.Based on single factor tests，the method of orthogonal test with L9（34）was adopted，and the effects of pH value，enzymolysis temperature，cellulase dosage and enzymolysis time on the extraction rate of nuciferine were studied.The results showed that the optimum extraction condition was as follows：pH was 4.5，enzymolysis temperature was 45℃，cellulase dosage was 1.5 mg/g，and enzymolysis time was 50 min.Under these conditions，the extraction rate of nuciferine was 0.536%.The optimum extraction condition is reasonable and scientific，and it could be used in future large-scaled preparation.

Nelumbo nucifera leaves；nuciferine；cellulase；reflux method；extraction

S853.72

A

0529-6005（2016）09-0102-03

2015-08-03

國(guó)家科研平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目［發(fā)改高技（2013）2064號(hào)］；貴州省民族中獸藥與生態(tài)畜牧業(yè)人才基地項(xiàng)目［黔人領(lǐng)發(fā)（2013）15號(hào)］；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目［黔人領(lǐng)發(fā)（2012）3號(hào)］；貴州省銅仁市科技局科研計(jì)劃項(xiàng)目［銅仁市研（2012）62號(hào)］

寧娜（1984-），女，副教授，博士，從事藥用資源的開(kāi)發(fā)利用工作，E-mail：ningnaok@163.com