裴星瑤，王　旗，謝　潔，2，謝三磊，彭　濤，李向梅，江海洋

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 朝陽(yáng) 100176）

熒光微球免疫層析法快速檢測(cè)雞飼料中喹乙醇的含量

裴星瑤1，王旗1，謝潔1，2，謝三磊1，彭濤1，李向梅1，江海洋1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 朝陽(yáng) 100176）

為更靈敏地進(jìn)行全價(jià)雞飼料中喹乙醇（OLA）含量的快速檢測(cè)，本研究將新型標(biāo)記物熒光微球與喹乙醇單克隆抗體偶聯(lián)，以該復(fù)合物為檢測(cè)試劑制備熒光微球免疫層析試紙條，在肉眼檢測(cè)的同時(shí)，將該裝置與熒光微球定量側(cè)向?qū)游鲎x數(shù)儀聯(lián)合使用，可進(jìn)行全價(jià)雞飼料中喹乙醇含量的定量快速檢測(cè)。研究結(jié)果證明，飼料中喹乙醇的定性和定量檢測(cè)限分別為100 μg/kg和0.51 μg/kg，IC50值為1.89 ng/mL，定量檢測(cè)回收率為78.71%～90.83%。該試紙條特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，保存期長(zhǎng)。定量檢測(cè)只需18 min左右，肉眼檢測(cè)需38 min左右，與相同抗原和抗體制備的膠體金試紙條相比，該方法可大大提高靈敏度。

喹乙醇；熒光微球；免疫層析；雞飼料

喹乙醇（OLA）被廣泛用于提高飼料轉(zhuǎn)化效率、加速動(dòng)物生長(zhǎng)和防止動(dòng)物細(xì)菌疾?。?］。然而其不規(guī)范使用存在嚴(yán)重副作用，威脅家畜和人類(lèi)健康［2］。鑒于此，歐盟于1998年禁止OLA使用［3］。然而當(dāng)今OLA非法添加依然日趨嚴(yán)重，其中家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中使用居多，可能導(dǎo)致OLA殘留在雞肉和環(huán)境中。

OLA檢測(cè)方法發(fā)展迅速，其中傳統(tǒng)儀器分析方法已被大量報(bào)道，如高效液相色譜法（HPLC）［4-6］，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）［7-9］等。這些經(jīng)典方法準(zhǔn)確可靠，但由于操作復(fù)雜、成本昂貴，無(wú)法進(jìn)行大量樣本實(shí)時(shí)分析［10］。此外，OLA免疫檢測(cè)方法也逐漸發(fā)展，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）由于其固有優(yōu)勢(shì)倍受關(guān)注［11］，然而，設(shè)備的需要，相對(duì)復(fù)雜的預(yù)處理和相對(duì)較低的效率限制了養(yǎng)殖場(chǎng)和市場(chǎng)中對(duì)ELISA方法的應(yīng)用。

近年來(lái)，免疫層析檢測(cè)技術(shù)由于簡(jiǎn)便快速、方便攜帶以及成本低的特性被逐漸應(yīng)用。其中僅有一篇關(guān)于用膠體金試紙條檢測(cè)飼料中OLA的報(bào)道，但為定性檢測(cè)，LOD值（2 000 ng/mL）較高［12］，靈敏度不能滿足監(jiān)測(cè)要求。因此，利用更靈敏的標(biāo)記物建立同時(shí)定量、定性檢測(cè)雞飼料中OLA的免疫層析檢測(cè)方法極其必要。本文首次建立了熒光微球免疫層析法檢測(cè)OLA，提高了檢測(cè)靈敏度，為快速監(jiān)測(cè)禽類(lèi)養(yǎng)殖安全提供技術(shù)保障。

1　材料與方法

1.1主要材料與儀器牛血清白蛋白（BSA，99.9%），羊抗鼠二抗免疫球蛋白（G×M），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；OLA單克隆抗體（Anti-OLA MAb，2.65 mg/mL）由本實(shí)驗(yàn)室制備和儲(chǔ)存［13］；MES（上海超日公司）；熒光微球（0.22 μm）、EDC、NHS（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；PVC底板、樣品墊、吸水墊（上海杰一公司）；硝酸纖維素膜Millipore135（美國(guó)Millipore公司）；ZX1000噴膜儀（美國(guó)BioDot公司）；三用紫外分析儀WFH-203（ZF-1）（上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司）；定量讀數(shù)儀（德國(guó)QIAGEN公司）。

1.2熒光微球偶聯(lián)抗體復(fù)合物的制備30 μL熒光微球加入1 mL MES（pH值6.0）中，混合后，加入反應(yīng)劑10 μL EDC和10 μL NHS（均為0.5 mg/mL）活化15 min。用含有0%，1%，5%和10%BSA的純水溶液分別稀釋抗體至2.65 μg/mL，取30 μL抗體稀釋液逐滴加入熒光微球溶液中反應(yīng)15 min，加入20 μL BSA（20%）封閉10 min，以10 000 r/min離心5 min，沉淀用200 μL復(fù)溶液重懸，4℃避光保存。

1.3熒光微球免疫層析試紙條制備

1.3.1樣品墊的制備在樣品墊處理液（含1% PVP和3‰NaN3的PB溶液）中分別加入0%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的Tween-20，浸潤(rùn)處理玻璃纖維素膜，37℃烘干4 h，比較其背景信號(hào)值、熒光強(qiáng)度和靈敏度。

1.3.2熒光微球免疫層析試紙條的組裝用噴膜儀將OLA-BSA（0.86 mg/mL）和羊抗鼠IgG（0.20 mg/mL）分別噴涂在NC膜上，37℃干燥30 min。將NC膜、樣品墊和吸水墊依次粘貼在PVC板上，用切條機(jī)裁成3.5 mm寬的試紙條。

1.4試紙條檢測(cè)方法和結(jié)果判定在ELISA微孔中加入3 μL標(biāo)記偶聯(lián)物，加入150 μL樣品孵育3 min，將試紙條斜插入孔底。10 min后用讀數(shù)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度，以B/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后在37℃干燥20 min，紫外燈下肉眼觀察，若T線有熒光亮度，樣品中不含OLA或低于該方法檢測(cè)限，判為陰性；反之為陽(yáng)性；C線為質(zhì)控線。

1.5試紙條性能檢測(cè)

1.5.1特異性用PBST溶液稀釋OLA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物MQCA、MEQ、QCT、CBX以及其他藥物SAL、CLE和AFB1至100 ng/mL，用試紙條檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次評(píng)價(jià)其特異性。

1.5.2靈敏度（1）定性檢測(cè)：OLA標(biāo)準(zhǔn)品用0.02 mol/L PBS溶解，在蛋雞全價(jià)配合飼料中的添加濃度為1，2.5，5，10，25，50，100，200，300 μg/kg和400 μg/kg，提取稀釋后用試紙條檢測(cè)，肉眼獲取定性檢測(cè)限；（2）定量檢測(cè)：在PBST（含0.1 g K2CO3）溶液中添加OLA至終濃度為0、0.1、0.3、1、3、9、27 ng/mL和81 ng/mL，用試紙條檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度重復(fù)5次。

1.6樣品前處理將全價(jià)配合雞飼料碾碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取1±0.1 g飼料粉末，加入2 mL現(xiàn)配的甲醇-水（5∶95）提取液，顛倒混勻后靜置10 min，取1 mL上清液，用PBST（含0.1g K2CO3）稀釋3倍，混勻后儲(chǔ)存于4℃待檢。

2　結(jié)果

2.1抗體稀釋液的確定抗體稀釋液可影響熒光微球和抗體的結(jié)合狀態(tài)，該研究選用含1%BSA的純水稀釋抗體，增強(qiáng)了抗體活性和T線熒光強(qiáng)度，減少抗體浪費(fèi)。但過(guò)多BSA搶占偶聯(lián)位點(diǎn)，起到類(lèi)似封閉液的作用［14］，顯色降低（見(jiàn)圖1）。

圖1　抗體稀釋液的選擇結(jié)果（ng/mL）

2.2樣品墊的制備檢測(cè)結(jié)果表明，0.4%Tween-20加入樣品墊處理液跑樣速度較前二者快，靈敏度高（見(jiàn)圖2）。背景信號(hào)趨勢(shì)也表示Tween-20在一定范圍內(nèi)可減少熒光微球抗體復(fù)合物與NC膜的非特異性結(jié)合，但過(guò)多的Tween-20會(huì)使抗體遷移速度過(guò)快，熒光值下降。

圖2　不同濃度的Tween-20調(diào)制樣品墊處理液的結(jié)果

2.3試紙條檢測(cè)效果

2.3.1試紙條的特異性試紙條與MQCA和MEQ有少量交叉反應(yīng)，其明顯程度不影響肉眼判定，對(duì)其他分析物都無(wú)明顯交叉反應(yīng)，證明試紙條具有良好的特異性。

2.3.2試紙條的靈敏度紫外光下肉眼觀察，試紙條的定性檢測(cè)限為100 μg/kg。用讀數(shù)儀測(cè)量熒光信號(hào)，以B/B0為縱坐標(biāo)，樣品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性范圍為0.39～43.71 ng/ mL（R2=0.9969），IC50為1.89 ng/mL，定量檢測(cè)限為0.51 μg/kg（見(jiàn)圖3）。

圖3　試紙條定性檢測(cè)靈敏度結(jié)果和定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條在4℃和室溫儲(chǔ)存6個(gè)月后，熒光強(qiáng)度較穩(wěn)定。分別選取同批次和不同批次的試紙條，在相同條件下檢測(cè)，結(jié)果表明，試紙條重復(fù)性良好。

2.3.4添加回收率在空白全價(jià)配合雞飼料中添加OLA至0.5、2、4 μg/kg，用試紙條檢測(cè)并計(jì)算其平均回收率為78.71%～90.83%。用試紙條與ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)17份全價(jià)雞飼料樣本，陽(yáng)性符合率為90.91%，陰性符合率為100%。

3　討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熒光微球標(biāo)記過(guò)程在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中的重要性，其優(yōu)化直接影響到抗體與熒光微球的偶聯(lián)程度和蛋白活性?？贵w稀釋液中的BSA，良好的反應(yīng)強(qiáng)化劑或穩(wěn)定劑，在本文中被作為一個(gè)重要調(diào)節(jié)參數(shù)。BSA常常被添加在ELISA檢測(cè)試劑中，提高穩(wěn)定性，減少非特異性結(jié)合，加強(qiáng)蛋白反應(yīng)的活性［15］。本試驗(yàn)中選擇的BSA濃度，表現(xiàn)出最佳熒光強(qiáng)度和靈敏度。如果BSA過(guò)少，抗體和熒光微球偶聯(lián)體系不穩(wěn)定，肉眼可見(jiàn)少量聚沉現(xiàn)象，且蛋白活性較低，T線熒光亮度較低。如果BSA過(guò)多，會(huì)占據(jù)偶聯(lián)位點(diǎn)，影響T線信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度。同時(shí)，本試驗(yàn)中添加的BSA能減少抗體的浪費(fèi)。

試紙條的分辨率是評(píng)價(jià)其性能的指標(biāo)之一。相對(duì)膠體金來(lái)說(shuō)，熒光微球粒徑較大，增加了非特異性結(jié)合的可能，背景值在一定程度上會(huì)造成儀器讀數(shù)的誤差。熒光信號(hào)比較靈敏，細(xì)微的變化易引起結(jié)果的變異，并影響靈敏度。已有報(bào)道表明，樣品洗脫液中的Tween-20會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)層析速度提高免疫層析方法的靈敏度［16］。為了改善背景影響，我們利用0.4%Tween-20調(diào)制樣品墊，提高了T線熒光強(qiáng)度和靈敏度，建立了顯色清晰而判定靈敏的熒光微球免疫層析試紙條。實(shí)際證明本試紙條可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)全價(jià)配合雞飼料中的OLA，為禽類(lèi)養(yǎng)殖安全的監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)。

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Rapid Detection of Olaquindox in Chicken Feed Based on Fluorescent Microspheres Lateral Flow Assay

PEI Xing-yao1，WANG Qi1，XIE Jie1，2，XIE San-lei1，PENG Tao1，LI Xiang-mei1，JIANG Hai-yang1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.China Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China）

In order to detect the olaquindox more sensitivily，the monoclonal antibodies of olaquindox were conjugated with the fluorescent microspheres to build a fluorescent microspheres immunoassay strip not only for the qualitative detection but also for the quantitative detection for olaquindox residue in complete pellet chicken feed，when the strip was coupled to a membrane strip reader.When the qualitative assay with the LOD of 100 ng/g and the quantitative assay with the LOD of 0.51 μg/kg for feed（IC50=1.89 were performed，coefficient of recovery was 78.71～90.83%.The test strip was demonstrated to have high specificity，satisfying accuracy and excellent stability.The fluorescent lateral flow assay which needs only 18 min for quantitative detection and 38 min for qualitative detection was confirmed to be more sensitive than colloidal gold technique developed with the same antigen and antibody.

olaquindox；fluorescent microspheres；immunofluorescence；chicken feed

JIANG Hai-yang

S859.79

A

0529-6005（2016）09-0083-03

2015-07-24

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2015BAK36B03）

裴星瑤（1991-），女，碩士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail：beidoubujianbei@163.com，

江海洋，E-mail：haiyang@cau.edu.cn