任　超，曹　威，張文波，金天明

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 西青 300384）

ATRA對(duì)新城疫疫苗的體液免疫增強(qiáng)作用的研究

任超，曹威，張文波，金天明

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 西青 300384）

為了研究全反式維甲酸（ATRA）對(duì)新城疫疫苗的體液免疫增強(qiáng)效果，本試驗(yàn)選取1日齡AA肉雞作為研究對(duì)象，低劑量組和高劑量組分別灌服1 μmol/kg體重和5 μmol/kg體重ATRA，在7日齡和28日齡時(shí)對(duì)藥物對(duì)照組、低劑量組、高劑量組通過滴鼻、點(diǎn)眼的方法免疫新城疫疫苗。在7、14、21、28、35、42日齡和49日齡，每組隨機(jī)取7只雞，稱重，采集胸腺、脾臟、腔上囊和血清，計(jì)算胸腺、脾臟和腔上囊免疫器官指數(shù)，利用血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測(cè)血清中新城疫抗體效價(jià)。結(jié)果表明，ATRA可以促進(jìn)雛雞免疫器官生長(zhǎng)，提高雛雞免疫器官指數(shù)和新城疫抗體效價(jià)，表明ATRA可以增強(qiáng)雛雞的體液免疫應(yīng)答，且5 μg/kg體重劑量ATRA對(duì)新城疫疫苗的體液免疫增強(qiáng)效果更顯著。

ATRA；新城疫疫苗；體液免疫；免疫增強(qiáng)；免疫器官指數(shù)

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的主要活性代謝衍生物，在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)與抑制腫瘤的發(fā)生方面起著重要的作用［1］。Kaufman等研究表明，維生素A稍有不足就會(huì)顯著削弱疫苗在腸黏膜誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，而短期補(bǔ)充維生素A就可以完全恢復(fù)機(jī)體的腸道免疫力，而且能夠促進(jìn)效應(yīng)性體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，口服或皮下注射的ATRA通過刺激皮膚引流淋巴結(jié)內(nèi)的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生更多的ATRA并誘導(dǎo)嗜腸T、B淋巴細(xì)胞由腸外的淋巴組織歸巢到腸黏膜部位［3-4］。在白血病小鼠模型中，ATRA和DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用能夠有效的促進(jìn)INF-γ的產(chǎn)生和殺傷性T細(xì)胞的產(chǎn)生［5］?？梢夾TRA能夠有效的促進(jìn)機(jī)體的黏膜免疫反應(yīng)，并調(diào)動(dòng)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，協(xié)同提高機(jī)體的免疫力。因此，ATRA可以作為潛在的免疫增強(qiáng)劑，在畜禽疫苗免疫中發(fā)揮良好的免疫增強(qiáng)作用。本研究將ATRA配合新城疫Ⅳ系疫苗，探索ATRA對(duì)家禽體液應(yīng)答的作用，為研發(fā)安全高效的禽用免疫增強(qiáng)劑開辟新的道路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1日齡AA肉雞196只，購自天津景盛源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司。

1.2主要試劑ATRA（美國(guó)Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司）；新城疫Ⅳ系疫苗（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司）；新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

1.3主要儀器離心機(jī)（上海醫(yī)療儀器廠，LW-250A），振蕩器（金壇市龍盛實(shí)驗(yàn)儀器廠，ZW-A），排槍（百得實(shí)驗(yàn)室儀器（蘇州）有限公司，725010）。

1.4免疫程序制定ATRA用DMSO溶解，濃度為0.1 mg/L，-80℃保存。各組均為49只AA肉雞，在1日齡時(shí)，高劑量組和低劑量組分別灌服5 μmol/kg體重和1 μmol/kg體重的ATRA，連續(xù)灌服7 d，藥物對(duì)照組和免疫對(duì)照組分別灌服等量DMSO。在7日齡和28日齡時(shí)，高劑量組、低劑量組和藥物對(duì)照組分別免疫新城疫Ⅳ系疫苗，免疫劑量106.0EID50/羽，免疫途徑為滴鼻、點(diǎn)眼，免疫對(duì)照組免疫等量生理鹽水。

1.5樣品采集與處理在7、14、21、28、35、42日齡和49日齡，每組隨機(jī)取7只雞，翅靜脈采血，稱重，斷頸處死，采集胸腺、脾臟和腔上囊，稱重并計(jì)算免疫器官指數(shù)（免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮重（g）/宰前活重（g）×100%）。將血液分離血清，利用血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測(cè)血清中新城疫抗體效價(jià)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，圖表用Graphad Prism軟件繪制，以（D）表示。

2　結(jié)果

2.1免疫器官指數(shù)的測(cè)定脾臟免疫器官指數(shù)在14日齡時(shí)低劑量組顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.05）；21日齡時(shí)高劑量組顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.05）；28日齡時(shí)高劑量組、低劑量組均顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；35日齡時(shí)各組差異不顯著（P＞0.05）；42日齡時(shí)高劑量組、低劑量組均顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；49日齡時(shí)高劑量組、低劑量組均顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.05）（見圖1）。所以ATRA可以促進(jìn)脾臟生長(zhǎng)，提高雛雞脾臟免疫器官指數(shù)。

圖1　脾臟免疫器官指數(shù)圖

腔上囊免疫器官指數(shù)在14日齡和49日齡時(shí)各組差異不顯著（P＞0.05）；21日齡時(shí)高劑量組極顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.01）；28日齡時(shí)高劑量組極顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.01），低劑量組極顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.01）；35日齡時(shí)高劑量組顯著高于免疫對(duì)照組、藥物對(duì)照組和低劑量組（P＜0.05），低劑量組顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.05）；42日齡時(shí)高劑量組極顯著高于藥物對(duì)照組和低劑量組（P＜0.01）（見圖2）。所以ATRA可以促進(jìn)腔上囊生長(zhǎng)，提高雛雞腔上囊免疫器官指數(shù)。

圖2　腔上囊免疫器官指數(shù)圖

胸腺免疫器官指數(shù)在14日齡時(shí)高劑量組極顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.01），低劑量組顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.05）；21日齡時(shí)高劑量組顯著高于免疫對(duì)照組和藥物對(duì)照組（P＜0.05），低劑量組極顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.01），低劑量組顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；28日齡時(shí)高劑量組顯著高于免疫對(duì)照組（P＜0.05）；35日齡時(shí)各組差異不顯著（P＞0.05）。所以ATRA可以促進(jìn)胸腺生長(zhǎng)，提高雛雞胸腺免疫器官指數(shù)（見圖3）。

圖3　胸腺免疫器官指數(shù)圖

2.2新城疫抗體效價(jià)測(cè)定免疫對(duì)照組的新城疫抗體水平逐漸下降，而藥物對(duì)照組、高劑量組、低劑量組的新城疫抗體水平在1免后逐漸上升，在28日齡（1免后21 d）達(dá)到高峰；2免后藥物對(duì)照組、高劑量組、低劑量組的新城疫抗體水平繼續(xù)上升，在42日齡（2免后14 d）第二次達(dá)到高峰，并維持至49日齡。新城疫抗體效價(jià)在14日齡時(shí)（1免后7 d）各組差異不顯著（P＞0.05）；21日齡時(shí)（1免后14 d）高劑量組顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；28日齡時(shí)（1免后21 d）高劑量組、低劑量組分別顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；35日齡時(shí)（2免后7 d）高劑量組顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；42日齡時(shí)（2免后14 d）高劑量組極顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.01），高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05），低劑量組顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.05）；49日齡時(shí)（2免后21 d）高劑量組極顯著高于藥物對(duì)照組（P＜0.01），高劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）。由此可見在ATRA的作用下，雛雞的新城疫抗體效價(jià)顯著提高，且高劑量組的抗體增長(zhǎng)水平較其他組更顯著（見圖4）。

圖4　新城疫抗體效價(jià)圖

3　討論

胸腺、腔上囊和脾臟是禽類最重要的免疫器官，其發(fā)育狀態(tài)及機(jī)能強(qiáng)弱對(duì)禽類的免疫水平有很大的影響，免疫器官的重量相對(duì)增加，說明機(jī)體的免疫機(jī)能增強(qiáng)［6］。從結(jié)果可知，ATRA能夠促進(jìn)胸腺、腔上囊和脾臟的生長(zhǎng)，提高機(jī)體的免疫機(jī)能，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)。

ATRA通過大量表達(dá)核視網(wǎng)膜酸受體（RARα，-β和γ）產(chǎn)生信號(hào)，促進(jìn)多種免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞分化，上調(diào)T細(xì)胞歸巢受體的表達(dá)，促進(jìn)sIgA分泌型細(xì)胞的發(fā)育，ATRA在黏膜免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［7］。同時(shí)，ATRA也是維生素A衍生物中最強(qiáng)有力的恢復(fù)體液免疫反應(yīng)的活性物質(zhì)，可以增強(qiáng)Th2型細(xì)胞的分化，抑制Th1型細(xì)胞的分化，促進(jìn)基因免疫誘生Th2型免疫應(yīng)答，抑制Th1型免疫應(yīng)答，從而改變基因免疫，誘生特異性體液免疫反應(yīng)［8］。本試驗(yàn)不同濃度ATRA對(duì)新城疫疫苗的免疫效果影響，從結(jié)果可知，ATRA可以提高新城疫的抗體效價(jià)，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，且5 μg/kg體重劑量ATRA對(duì)新城疫疫苗的免疫增強(qiáng)效果更顯著。

［1］劉爽，湯鋒，劉琦，等.全反式維甲酸對(duì)卵巢上皮腺癌細(xì)胞株抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（4）：1601-1604.

［2］Kaufman D R，De Calisto J，Simmons N L，et al.Vitamin A Deficiency Impairs Vaccine-Elicited Gastrointestinal Immunity［J］.J Immunol，2011，187（4）：1877-1883.

［3］Hammerschmidt S I，F(xiàn)riedrichsen M，Boelter J，et al.Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice［J］.J Clin Invest，2011，121（8）：3051-3061.

［4］Villablanca E J，Wang S，De Calisto J，et al.MyD88 and Retinoic Acid Signaling Pathways Interact to Modulate Gastrointestinal Activities of Dendritic Cells［J］.Gastroenterology，2011，141（1）：176-185.

［5］Kouichi F，Katerina P，Carole L P，et al.DNA vaccination with all-trans retinoic acid treatment induces long-term survival and elicits specific immune responses requiring CD4+and CD8+T-cell activation in an acute promyelocytic leukemia mouse model［J］.Blood，2010，115（3）：653-656.

［6］李亞杰，趙獻(xiàn)軍.益生菌、黃芪多糖微膠囊制劑對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)及血液生化指標(biāo)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（1）：100-103.

［7］Svensson M，Johansson-Linbom B，Zapata F，et al.Retinoic acid receptor signaling levels and antigen dose regulate gut homing receptor expression on CD8 T cells［J］.Mucosl Immunol，2008，1：38-48.

［8］喻三紅，夏明燦，王立新，等.全反式維甲酸對(duì)基因免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24（5）：337-340.

TheImmuneenhancement of ATRA in Humoral Immune Responsefor NewcastleDiseaseVaccine

REN Chao，CAO Wei，ZHANG Wen-bo，JIN Tian-ming
（Department of Animal Sciences and Veterinary Medicine，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

In order to study the immunity enhancement of ATRA for Newcastle Disease（ND）vaccine，1-day-old AA broilers were treated with ATRA at 1 mmol/kg and 5 mmol/kg respectively.At the 7thday and 28thday the drug control group，low dose group，and high dose group were immunized with ND vaccine by intranasal and eye immunization approach.At the 7th，14th，21st，28th，35th，42ndand 49thday 7 chickens in each group were randomly selected to be weighed，and the thymus，spleen，bursa and serum were collected for calculating the thymus，spleen and bursa immune organ index and detecting the ND specific antibody titers with HI test.The results showed that ATRA could promote the immune organ growth to improve the immune organ index and ND specific antibody titers.Meanwhile，ATRA also extended the duration of the ND specific antibody titers，indicating that ATRA enhanc the humoral immune response of chickens，and the immune enhancing effect for ND vaccine of the group treated with ATRA at 5 μg/kg was significantly differencet.

ATRA；ND vaccine；humoral immunity；immune enhancement；immune organ index

JIN Tian-ming

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）09-0019-03

2015-07-10

天津農(nóng)學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（2013N09）；天津市高?！矮F醫(yī)生物技術(shù)”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD12-5019）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（TNTD2015015）

任超（1986-），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榛A(chǔ)獸醫(yī)學(xué)，E-mail：chaoren04050110@163.com

金天明，E-mail：jtm680@163.com