范巖巖，劉倩倩，張廷榮，孫金海

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109）

轉(zhuǎn)pGH IGF-1基因?qū)ωi生長和繁殖性能的影響

范巖巖，劉倩倩，張廷榮，孫金海

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109）

為了解轉(zhuǎn)雙基因在豬生長發(fā)育中作用及意義，選取23頭健康仔豬，其中轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬4頭，轉(zhuǎn)pGH基因豬12頭，非轉(zhuǎn)基因豬7頭，研究pGH、IGF-1基因?qū)ωi生長和繁殖性能的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬個體均重比轉(zhuǎn)pGH單基因豬高2.83%，差異顯著（P＜0.05）；轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬高7.37%，差異顯著（P＜0.05）。轉(zhuǎn)雙基因豬體重達100 kg的日齡比轉(zhuǎn)單基因豬少8.93 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少12.23 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)單基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少3.30 d，差異不顯著（P＞0.05）；轉(zhuǎn)雙基因公豬的精液量，分別比轉(zhuǎn)pGH單基因公豬與非轉(zhuǎn)基因公豬提高27.61%、18.31%，差異均顯著（P＜0.05）；精子密度，三者之間差異均不顯著（P＞0.05）；轉(zhuǎn)雙基因公豬與非轉(zhuǎn)基因豬的精子活力之間差異不顯著（P＞0.05）；轉(zhuǎn)單基因公豬畸形率分別比轉(zhuǎn)雙基因公豬、非轉(zhuǎn)基因豬高23%、18%，差異均顯著（P＜0.05）。為進一步分析pGH-IGF-1生長軸對家豬生產(chǎn)性能的具體影響提供參考依據(jù)，也為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的推廣與應(yīng)用提供有力依據(jù)。

豬；生長激素（GH）；胰島素樣生長因子（IGF）；生長性能；繁殖性能

動物生長通過促生長激素軸控制，由生長激素釋放因子（GHRH）、胰島素樣生長因子（IGFs）、生長激素（GH）構(gòu)成，各激素之間發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，共同調(diào)控機體的整個生長發(fā)育過程［1］。pGH能夠減少脂肪組織對葡萄糖的利用，降低Co A羧化酶和脂肪合成酶的活性，抑制脂肪的合成［2］。同時，pGH還能有效促進脂肪組織的分解［3］，從而使豬的背膘厚和胴體脂肪含量下降。IGFs是GH-IGF中的重要調(diào)控因子，是pGH發(fā)揮生物學作用的主要介導者［4］。Davies等［7］研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1無功能變異小鼠因為缺乏IGF-1導致其成年后間質(zhì)細胞不能成熟，導致類固醇分泌的減少，IGF-1基因控制著睪丸的功能［5］，生長軸對動物繁殖起著至關(guān)重要的作用。

2013年本實驗室，姚延珠等［6］將雙基因重組真核表達載體用納米材料包裹后轉(zhuǎn)染長白豬精子，通過人工授精導入受體母豬。待其產(chǎn)仔后，經(jīng)檢測其中4頭仔豬為轉(zhuǎn)雙基因豬，轉(zhuǎn)雙基因陽性率為30.76%，成功制備出轉(zhuǎn)（pGH-IGF-1）雙基因豬。本試驗從生產(chǎn)數(shù)據(jù)角度進一步分析pGHIGF-1生長軸對家豬生產(chǎn)性能的具體影響。

1　材料與方法

1.1試驗動物的選擇試驗于2013年10月至2014年10月在青島農(nóng)業(yè)大學實驗基地種豬場進行。選取同品種2頭轉(zhuǎn)雙基因母豬與正常公豬雜交，得到23頭健康仔豬并取耳組織樣，檢測后代中轉(zhuǎn)雙基因、轉(zhuǎn)單基因的子代個數(shù)，測得數(shù)據(jù)。

引物的設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬pGH基因序列（GenBank=M17704.1）和IGF-1基因序列（GenBank=M31175.1），利用Prime Premier5.0分別設(shè)計上、下游引物：

pGH F：5′-ATGCCCTTGTCCAGCCTAT R：AGGTATGTCTCAGCCTTGTGC-3′；

IGF-1 F：5′-TGCCCTTGTCCAGCCTATTT R：GCAGGTATGTCTCAGCCTTGTG-3′。

1.2測定項目

1.2.1測定體重測定豬不同日齡試驗豬體重和3月齡、5月齡、6月齡體尺及體重100 kg時等指標。對體重在85～105 kg范圍的試驗豬，記錄實測日齡和體重，按加拿大校正公式轉(zhuǎn)換成體重達100 kg的日齡。

校正日齡=測定日齡-［（實測體重-100）/CF］

其中：（公豬）CF=（實測體重/測定日齡）× 1.826；（母豬）CF=（實測體重/測定日齡）×1.715。

前文不避瑣贅，對清初傳記散文中遺民形象書寫的道德范式做四個方面的梳理，然尚有一個重要的問題，亦需做出系統(tǒng)的解釋，即這些傳記散文中遺民道德范式的實現(xiàn)途徑。茲試作粗略之解如下。

1.2.2射精量測量精液量主要用電子天平稱量法。按1 g=1 mL計，精液量（g）=（精子的質(zhì)量+集精杯的質(zhì)量）集精杯子的質(zhì)量。盡量避免用量筒轉(zhuǎn)移精液造成精子的死亡。

1.2.3精子活力檢測方法：用100 μL移液器準確吸取50 μL樣品，取0.95 mL的3.0%氯化鈉溶液與精液混合均勻。將備好的血球計數(shù)板用血蓋片將計數(shù)室蓋好，用小吸管吸取，滴一滴于血蓋片邊緣，使精液自行流入計數(shù)室，均勻充滿，避免氣泡和液層過厚，然后用顯微鏡觀察計數(shù)。計算方法：3個視野活力評價值的平均數(shù)。如下：式中：M 表示活力；n1表示第一視野活力；n2表示第二視野活力；n3表示第三視野活力。

1.2.4精子密度檢測正常情況下公豬的精子密度為3～5億/mL，有的可高達7億/mL。檢測精子密度的方法主要有估測法、精子密度儀法、血細胞計數(shù)方法等。本試驗使用精子密度儀進行檢測。

1.2.5精子畸形率檢測制作精子抹片，用姬姆薩染料對精子進行染色，用普通顯微鏡進行觀察，計算畸形百分率。具體方法如下：（1）抹片：在載玻片的一端滴一滴精液，然后取另一載玻片與有樣品的載玻片呈35°夾角，輕輕推動載玻片，將精液均勻地涂抹于載玻片上，靜置約10 min風干，每組樣品制作兩個精子抹片；（2）固定：取1.0 mL～2.0 mL中性福爾馬林固定液，滴在已風干的抹片上，靜置15 min，用清水將固定液吹去，待吹干或自然風干后染色；（3）染色：將配好的姬姆薩染液滴在固定好后的抹片，染色2 h后沖去染液，涼干待檢；（4）鏡檢：在顯微鏡下觀察制備好的精子抹片，每個抹片觀察精子200個以上，記錄抹片上畸形精子個數(shù)，取兩片的平均值，如兩片的畸形率相差大于6則認為不符合要求應(yīng)重新檢測。

精子畸形率計算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1仔豬轉(zhuǎn)基因數(shù)的測定仔豬轉(zhuǎn)基因豬的PCR檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測出轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬4頭，轉(zhuǎn)pGH基因豬12頭，非轉(zhuǎn)基因豬7頭，如圖1、2所示：

2.2仔豬不同日齡體重的分析對23頭試驗豬不同日齡進行體重生長的測定，比較同期轉(zhuǎn)

圖2　IGF-1基因PCR擴增結(jié)果

pGH、IGF-1雙基因豬、轉(zhuǎn)pGH單基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬生長性能，結(jié)果如表1所示。

由表1統(tǒng)計分析結(jié)果可以看出，除30日齡和90日齡體重外，轉(zhuǎn)雙基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬各月齡均差異顯著（P＜0.05），在30日齡時，轉(zhuǎn)單基因豬的體重高于轉(zhuǎn)雙基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬。其后，轉(zhuǎn)雙基因豬生長迅速，60日齡體重超過轉(zhuǎn)單基因和非轉(zhuǎn)基因豬?？偟膩碚f，轉(zhuǎn)雙基因豬分別比轉(zhuǎn)單基因豬、非轉(zhuǎn)基因豬高2.83%、7.37%，差異顯著（P＜0.05）。

2.3F1代的轉(zhuǎn)基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬生長分析

表1仔豬不同日齡的體重　　單位：kg

2.3.1不同時期轉(zhuǎn)基因豬的體尺對比對23頭試驗豬3月齡、5月齡、6月齡進行體尺生長的測定，比較同期轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬、轉(zhuǎn)pGH單基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬，結(jié)果如表2所示。

表2　不同時期仔豬體尺

從表2可以看出，5月齡時，轉(zhuǎn)雙基因豬、轉(zhuǎn)單基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬的體高均差異顯著（P＜0.05）；轉(zhuǎn)雙基因豬和轉(zhuǎn)單基因豬的胸圍差異不顯著（P＞0.05），但都顯著高于非轉(zhuǎn)基因豬。6月齡時，3者之間在體高、體長兩個指標上均差異顯著（P＜0.05）?？偟膩碚f，在體尺指標上，無論是體高、體長還是胸圍，轉(zhuǎn)雙基因豬優(yōu)于轉(zhuǎn)單基因豬，轉(zhuǎn)單基因豬優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因豬。

2.3.2仔豬體重達100 kg的日齡控制試驗豬的體重在80～110 kg范圍之內(nèi)，轉(zhuǎn)雙基因豬體重達100 kg的日齡為171.07 d，轉(zhuǎn)單基因為180.00 d，非轉(zhuǎn)基因為183.30 d。轉(zhuǎn)雙基因豬比轉(zhuǎn)單基因豬少8.93 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少12.23 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)單基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少3.3 d，差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，轉(zhuǎn)雙基因豬的的生長潛力最大，其次為轉(zhuǎn)單基因豬，非轉(zhuǎn)基因豬的生長潛能最弱小。

2.3.3檢測精液量、精子密度、精子活力和畸形率采集6月齡公豬（轉(zhuǎn)雙基因2頭，轉(zhuǎn)單基因6頭，非轉(zhuǎn)基因3頭）精液，在光鏡下統(tǒng)計計算精子品質(zhì)如圖3，分別測定數(shù)據(jù)，如表3所示：

表3　不同公豬精液品質(zhì)

圖3　光鏡下精子活力圖?。?0×）

經(jīng)測量對比可以看出，就精液量而言，轉(zhuǎn)雙基因公豬分別與轉(zhuǎn)單基因公豬、非轉(zhuǎn)基因豬提高27.61%、18.31%，均差異顯著（P＜0.05）；精液密度，三者之間差異不顯著（P＞0.05）；精子活力，轉(zhuǎn)雙基因公豬與非轉(zhuǎn)基因公豬之間差異不顯著（P＞0.05）；畸形率，轉(zhuǎn)單基因公豬畸形率分別與轉(zhuǎn)雙基因公豬、非轉(zhuǎn)基因公豬高23%、18%，差異均顯著（P＜0.05）。

3　討論

3.1IGF-1基因與家豬生長繁殖的相關(guān)性IGF-1是一類多肽，調(diào)控著骨骼肌的生長發(fā)育，有研究表明，將IGF-1注入高齡或肌肉損傷的動物肌肉中，能夠促進成肌細胞快速增殖分化形成肌細胞，并且明顯增加肌肉重量［8］。Rhoads R.P.等［9］研究表明，降低營養(yǎng)水平使羊IGF-1基因表達量下降。IGF-1促進大鼠和豬初情期前支持細胞的增殖［10］，IGF-I促進未成熟間質(zhì)細胞有絲分裂。IGFs促進精原細胞DNA合成，體外培養(yǎng)時維持大鼠有絲分裂前DNA合成。IGF-1促進睪酮生產(chǎn)，對未成熟細胞的作用比成熟細胞明顯［11］。

結(jié)合本試驗數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)雙基因豬生長和繁殖優(yōu)于轉(zhuǎn)單基因豬優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因豬，與其他動物得到的結(jié)果一致。

3.2GH基因與家豬生長繁殖的相關(guān)性GH直接作用于肝臟、脂肪、肌肉等組織。有研究表明，注射入提純的南方黑鯛GH的歐亞魚盧表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢，大麻哈魚也顯現(xiàn)出額外的生長特性［12］。GH參與雄性動物的生殖調(diào)節(jié)，雄性動物的繁殖狀態(tài)伴隨著GH分泌水平的變化［13］。GH缺乏的雄性動物模型顯示多個內(nèi)分泌靶腺功能低下，生長和性發(fā)育障礙，精子形成受阻，GH替代治療可取得明顯效果［14］。從生產(chǎn)上測得的轉(zhuǎn)基因公豬精子的數(shù)據(jù)，可知轉(zhuǎn)基因的公豬精液體積和密度優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因公豬，但在精子活力方面非轉(zhuǎn)基因豬要優(yōu)于轉(zhuǎn)基因豬，特別是轉(zhuǎn)單基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬差異顯著（P＜0.05），可能是GH過量表達對精子活力產(chǎn)生一種阻礙，其原理有待進一步深入研究。

3.3pGH-IGF-1生長軸與家豬生產(chǎn)性能的相關(guān)性生長軸在動物的生長其中扮演了十分重要的角色，由動物體內(nèi)下丘腦-垂體-靶器官的一系列激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)［15］。GH經(jīng)血液循環(huán)至肝臟，與細胞膜表面的GH結(jié)合，促進IGFs的表達；IGFs通過血液循環(huán)到達機體的局部組織，促進組織細胞的生長和分化［16］。由GH刺激的肝臟及肝外組織中IGF-1 mRNA升高，IGF-1的合成與分泌增加。本試驗通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計，轉(zhuǎn)雙基因豬要比非轉(zhuǎn)基因豬體重增長快，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)雙基因要比轉(zhuǎn)單基因在生長更有優(yōu)勢，說明GH與IGF-1基因之間具有穩(wěn)定的聯(lián)系，兩者在家畜生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

［1］王子榮，趙茹茜，陳杰.通過生長軸調(diào)控動物生長［J］.草食家畜，1999，01：41-45.

［2］Etherton T D，Bauman D E.Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals［J］.Physiol Rev，1998，78：74-761.

［3］Pell J M，Bates P C.The nutritional regulation of growth hormone action［J］.Nutr Res Rev，1990，3：169-192.

［4］Perrini S，Laviola L，Carreiram C，et al.The GH/IGF1axis and signaling pathways in the muscle and bone：mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and osteoporosis［J］.J Endocrinol，2010，205（3）：201-210.

［5］Roser J F.Regulation of testicular function in the st al lion：an intricate network of endocrine，paracrine and autocrine systems［J］. Anim Reprod Sci，2008，107（3-4）：179-196.

［6］姚延珠.轉(zhuǎn)雙基因（pGH-IGF-1）豬的制備及檢測［J］.青島農(nóng)業(yè)大學學報，2015，03：39-62.

［7］Davies J S，Thompson N IM，Christian H C，et al.Hypothalamic expression of human growth hormone induces post-pubertal hypergonadotrophism in male trans genic growth rectarded rats［J］.Neuroendocrinol，2006，18（10）：719-731.

［8］Tapscoot S J，Davis R L，Thayer M J，et al.Myo D1：a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts［J］.Science，1988，242：405-411.

［9］Rhoads R P，Greenwood P L，Bell A W，et al.Nutritional regulation of the genes encoding the acid-labile subunit and other components of the circulating insulin-like growth factor system in the sheep［J］.J Animal Sci，2000，78（10）：2681-2689.

［10］Jaillard C，Chatelain P G，Saez J M.In vitro regulation of pig Sertoli cell growth and function：effects of fibroblast growth factor and somatomedin-C［J］.Biol Reprod，1987，37：665-674.

［11］胡義潔.轉(zhuǎn)基因豬pGH與IGF-1雙基因差異表達的研究［J］.青島農(nóng)業(yè)大學學報，2015，01：15-45.

［12］Gnessi L，F(xiàn)abbri A，Spera G.Gonadal peptides as mediators of development and functional control of the testis：an Integrated system with hormones and local environment［J］.Endocrine Reviews，1997，18（4）：541-609.

［13］Bunter K L，Cai W，Johnston D J，et al.Selection to reduce residual feed intake in pigs produces a correlated response in juvenile insulin-like growth factor-I concentration［J］.J AnimSci，2010，88（6）：1973-1981.

［14］Hartke J L，Monaco M H，Wheeler M B，et al.Effect of a shortterm fast on intestinal disaccharidase activity and villus morphology of piglets suckling insulin-like growth factor-I transgenic sows［J］.J Anim Sci，2005，83（10）：2404-2413.

［15］Li Z，Wu Z，Ren G，et al.Expression patterns of insulin-like growth factor system members and their correlations with growth and carcass traits in Landrace and Lantang pigs during postnatal development［J］.Mol Biol Rep，2013，40（5）：3569-3576.

［16］王開云，張國生，曾檢華，等.利用生長軸各激素調(diào)控動物生長［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2008，06：4-6.

S828

A

0529-6005（2016）09-0015-04

2016-01-26

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團隊投資項目（SDAIT-08-13）；科技部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08006-003）

范巖巖（1990-），男，碩士，主要從事動物遺傳育種學研究，E-mail：1013844827@qq.com

張廷榮，E-mail：zhangtr2006@126.com；孫金海，E-mail：sunjihai00528@sina.com