薛金英

（山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局山東濰坊262200）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測雞肉中氯霉素

薛金英

（山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局山東濰坊262200）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素。具有良好的抗菌效果且價格低廉，廣泛應(yīng)用于家禽的各種傳染性疾病的治療。但是氯霉素對造血系統(tǒng)有嚴(yán)重不良反應(yīng)，主要是抑制骨髓造血機(jī)能。因此，找到一種快速、簡便而又準(zhǔn)確的檢測方法成為了業(yè)界十分關(guān)注的課題。傳統(tǒng)上常用HPLC與TLC來作為抗生素檢測的方法，但效率低、靈敏度也達(dá)不到要求。酶聯(lián)免疫吸附法經(jīng)筆者實(shí)踐證明，操作簡便、試驗(yàn)過程短、檢測樣品多，特異性高，且檢測靈敏度最低可達(dá)0.01μg/L。

ELISA；雞肉；氯霉素

1　試驗(yàn)原理

采用直接競爭ELISA法檢測樣品中的氯霉素。包被抗原與加入的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品競爭抗體，加入酶標(biāo)記物，酶標(biāo)記物與抗體結(jié)合。通過洗滌除去游離的抗原、抗體及抗原抗體復(fù)合物。加入底物液，使結(jié)合到板上酶標(biāo)記物將底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。加入終止液，在450 nm處測定吸光度值與試樣中氯霉素的自然對數(shù)成反比。

2　實(shí)驗(yàn)儀器材料

1）儀器耗材:微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）、電子天平、振蕩器、均質(zhì)機(jī)、離心機(jī)、氮吹儀、離心管和玻璃試管、可調(diào)式5 μL～50 μL、20 μL～200 μL和100 μL～1000 μL微量移液器、拍板紙。

2）試劑：乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、去離子水或蒸餾水。

3）檢測試劑盒組成：包有氯霉素抗體的微孔板、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0號：0μg/L；1號：0.02μg/L；2號：0.06μg/L；3號：0.18μg/L；4號：0.36μg/L；5號：0.72μg/L）、20×濃縮洗滌液、10×濃縮樣品復(fù)溶液、5×氯霉素標(biāo)記HRP溶液、底物A溶液、底物B溶液、終止液、封板膜。

3　樣品提取（稀釋倍數(shù)為0.5倍）

現(xiàn)配1×樣品復(fù)溶液：10×濃縮樣品復(fù)溶液用蒸餾水稀釋10倍后使用。（如1 mL10×濃縮樣品復(fù)溶液加9 mL蒸餾水稀釋）。

1）稱取3 g已均質(zhì)的雞肉放入50 mL離心管中，加入4 mL1×樣品復(fù)溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配：10×濃縮樣品復(fù)溶液用蒸餾水稀釋10倍后使用，如1 mL10×濃縮樣品復(fù)溶液加9 mL蒸餾水稀釋），再加入6 mL乙酸乙酯，劇烈震蕩5 min；

2）室溫3 000 g離心5 min，取4 mL上層液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃試管中，于50℃下，氮?dú)鈱⒂袡C(jī)相吹干；

3）于此玻璃試管中加入正己烷2 mL，先將殘余物完全溶解后，再加入1 mL 1×樣品復(fù)溶液，震蕩30 s；

4）以3 000 g離心5 min，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備用。

4　檢測步驟

1）從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20～25℃）平衡30 min以上，注意每種試劑使用前均需搖勻。

2）1×氯霉素標(biāo)記HRP溶液的配制（現(xiàn)配現(xiàn)用）：將5×氯霉素標(biāo)記HRP溶液與1×樣品復(fù)溶液按照體積比1∶4混合均勻待用。

3）編號：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4）加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的試樣各100 μL到各自的微孔中，然后加入1×氯霉素標(biāo)記HRP溶液50 μL到每個微孔中。

5）溫育：用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，置于室溫環(huán)境中反應(yīng)15～20 min。

6）洗滌：取出酶標(biāo)板，將孔內(nèi)液體甩干，每孔加入1×洗滌液250 μ到每個板孔中，洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

7）顯色：加入底物液A液50 μL，再加入底物液B液50 μL到微孔中，輕輕振蕩混勻，室溫環(huán)境中避光顯色15～20 min。

8）測定：加入終止液50 μL到微孔中，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處，測定每孔吸光度值。

5　結(jié)果判定

1）按公式計算：

式中：B：標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光度值；B0：0濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

2）將計算的相對吸光度值對應(yīng)氯霉素的自然對數(shù)作半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，對應(yīng)的試樣濃度可從校正曲線算出，公式如下：

式中X:試樣中氯霉素含量，單位為μg/kg；A:試樣的相對吸光度值對應(yīng)的氯霉素含量，單位為μg/L；F:試樣的稀釋倍數(shù)；M:試樣的取樣量，單位為g。計算結(jié)果保留小數(shù)后兩位。

6　結(jié)論

本試驗(yàn)樣品最低檢測限為0.01 μg/kg，回收率一般在80%～110%之間，為確保結(jié)果準(zhǔn)確，試驗(yàn)過程中應(yīng)注意以下問題：

試劑盒應(yīng)冷藏保存，開封后的試劑盒應(yīng)盡快使用，試驗(yàn)前，提前將樣品及所需試劑從冰箱中拿出，平衡至室溫，以防檢測吸光度值偏低。試劑盒開封后3個月內(nèi)用完。若樣品的百分比吸光值（%）超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)使用1×樣品復(fù)溶液做適當(dāng)稀釋后測定。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液含氯霉素，請小心操作。不要使用過期的試劑盒，不同批號試劑不能混用?！觯ň庉?趙曉松）

Detection of Chloramphenicol in Chicken by ELISA

Xue Jinying
（Shandong Province Zhucheng Animal Husbandry and VeterAdministration，WeiFang ShanDong，262200）

Chloramphenicol（CAP）is a broad-spectrum antibiotic.Has a good antibacterial effect and low price，is widely used in poultry of various infectious diseases.However，chloramphenicol on hematopoietic system has serious adverse reactions，mainly to inhibit bone marrow hematopoietic function.Therefore，finding a fast，simple and accurate detection method has become a topic of great concern in food analysis field in recent years.Traditionally，HPLC and TLC have been used as the method of antibiotic detection，but the efficiency is low and the sensitivity is not up to the requirement.Enzyme-linked immunosorbent assay proved by the author，easy to operate，the test process is short，multi-sample detection，high specificity，and the detection sensitivity of up to 0.01μg/L.

ELISA；Chicken；Chloramphenicol.

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.10.043