吳高峰，黃占旺*，劉宛玲，牛麗亞，王素貞，黃永平

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

納豆凍干粉對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用及細(xì)胞因子分泌的影響

吳高峰，黃占旺*，劉宛玲，牛麗亞，王素貞，黃永平

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

本實(shí)驗(yàn)旨在探究納豆凍干粉（natto lyophilized powder，NLP）對(duì)昆明小鼠免疫功能及其細(xì)胞因子分泌的影響。選取體質(zhì)健康昆明小鼠128 只，隨機(jī)分為8 組：空白對(duì)照組（C組）、調(diào)節(jié)組（R0組和RN1、RN2、RN3組）4 組、預(yù)防組（P0、PN組）2 組、模型組（M組）。除C組外，其他各組灌胃3 d抗生素溶液，之后R0組灌胃生理鹽水，RN1～RN3組灌胃不同劑量的NLP溶液；預(yù)防組每天繼續(xù)灌胃抗生素溶液，8 h后P0、PN組分別灌胃生理鹽水和NLP溶液；M組灌胃抗生素溶液。30 d后測(cè)定免疫指標(biāo)及其細(xì)胞因子分泌量的變化情況。結(jié)果表明：與M組相比，低劑量的NLP能夠極顯著增加小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P＜0.01），RN1、RN2、RN3組小鼠血清中白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的分泌量極顯著增加（P＜0.01），同時(shí)，RN1、RN2、RN3組均能夠極顯著增加小鼠血清中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活力（P＜0.01），RN1、RN3組小鼠血清中白蛋白、球蛋白的含量和二者比值（白球比）及NO水平顯著或極顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。C組、調(diào)節(jié)組、預(yù)防組小鼠的血清溶血素水平較對(duì)照組均極顯著升高（P＜0.01）。RN1、RN2、RN3、PN組較M組均能夠極顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用（P＜0.01）。與C組相比，RN1、RN2、RN3組小鼠的半數(shù)溶血值顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。RN3和PN組可極顯著增加巨噬細(xì)胞吞噬百分率、雞紅細(xì)胞的吞噬數(shù)（P＜0.01）。結(jié)果表明NLP具有免疫增強(qiáng)作用和增加細(xì)胞因子分泌的作用。

納豆凍干粉；抗生素；免疫調(diào)節(jié)作用

免疫是機(jī)體必需的一種生理功能，它包括特異性免疫和非特異性免疫。免疫即機(jī)體通過(guò)識(shí)別自身與非己的物質(zhì)，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，清除抗原性異物，維持機(jī)體正常功能［1］。免疫系統(tǒng)是人體的生命防線，它由自身免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)組成，它能夠?qū)C(jī)體進(jìn)行免疫監(jiān)視、防御和調(diào)控［2］，由免疫器官、免疫細(xì)胞以及免疫因子組成。

目前我國(guó)抗生素濫用現(xiàn)象非常嚴(yán)重，中國(guó)的抗生素使用率超過(guò)七成，是歐美國(guó)家的兩倍多。而抗生素能夠通過(guò)抑制機(jī)體中微生物的生長(zhǎng)或者殺死微生物使得機(jī)體菌群失調(diào)，從而引起機(jī)體消化系統(tǒng)的潰敗，激起機(jī)體的免疫反應(yīng)［3］。研究表明，氨芐青霉素能夠降低中性白細(xì)胞（具有趨化、吞噬、殺菌作用）介導(dǎo)的致病菌殺滅功能［4］和增加血液中嗜堿性粒細(xì)胞（能夠促發(fā)過(guò)敏反應(yīng)）的釋放［5］。

納豆是日本傳統(tǒng)的健康發(fā)酵產(chǎn)品［6］。納豆凍干粉（lyophilized natto powder，NLP）是利用納豆菌發(fā)酵大豆制成納豆，然后添加脫脂奶粉作為凍干保護(hù)劑凍干后粉碎制成的，其制作方法簡(jiǎn)便、適宜工業(yè)化生產(chǎn)，且活菌數(shù)高、貯存方便。關(guān)于納豆及其產(chǎn)品對(duì)免疫的影響已有一些研究報(bào)道：張靜等［7］研究發(fā)現(xiàn)納豆片具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用；方少琳［8］和彭亮［9］等研究發(fā)現(xiàn)納豆凍干粉能提高小鼠免疫功能；沈柱英等［10］研究發(fā)現(xiàn)納豆菌糖肽對(duì)小鼠有免疫調(diào)節(jié)作用；由于抗生素濫用的現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重［11］，且抗生素的攝入抑制了人類免疫系統(tǒng)的正常功能［12］，而納豆凍干粉對(duì)于免疫功能的調(diào)節(jié)效果明顯，因此，本研究考察納豆凍干粉對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步研究納豆凍干粉對(duì)動(dòng)物腸道菌群的調(diào)節(jié)作用和對(duì)免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

納豆菌BN-1，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；納豆，自制。納豆凍干粉（NLP）由納豆添加脫脂奶粉作為凍干保護(hù)劑真空冷凍干燥制成，活菌數(shù)為1×1011CFU/g。

SPF級(jí)雌性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

鹽酸林可霉素、氨芐青霉素、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、伴刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA）、豚鼠血清、綿羊紅細(xì)胞、文齊氏試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Hank's液、RPMI-1640培養(yǎng)基 北京Solarbio公司；頭孢唑啉鈉 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胎牛血清 北京全式金生物技術(shù)有限公司；小鼠血清白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒武漢優(yōu)爾生生物科技有限公司；NO、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5200PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器股份有限公司；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀、3121型CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Labsystems公司；XD-202倒置顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TGL-20000-cR高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及其處理

NLP的有效活菌數(shù)為0.5×1010～1.0×1011CFU/g，將NLP配制成10、100、400 mg/mL的溶液，用于小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)。雌性昆明小鼠128 只，體質(zhì)量18～22 g，在SPF級(jí)環(huán)境中（光照比50%、相對(duì)濕度50%、室溫24～26 ℃、全新風(fēng)單向流動(dòng)）適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為8 組，每組16 只（每組分為兩批，組間體質(zhì)量差異≤0.5 g）：空白對(duì)照組（C組）、調(diào)節(jié)組（R0組和RN1、RN2、RN3組）4 組、預(yù)防組（P0、PN組）2 組、模型組（M組）。C組灌胃生理鹽水；其余組灌胃抗生素溶液3 d（鹽酸林可霉素、頭孢唑林鈉及氨芐青霉素的混合液，3 種抗生素質(zhì)量濃度均為100 mg/mL）建模后，R0組灌胃生理鹽水，RN1～RN3組分別灌胃低、中、高（109、1010、1011CFU/g）劑量的NLP；預(yù)防組每天繼續(xù)灌胃抗生素溶液8 h后，P0組灌胃生理鹽水，PN灌胃中劑量的NLP（1010CFU/g）；M組繼續(xù)灌胃抗生素溶液。實(shí)驗(yàn)期為30 d，灌胃量為0.5 mL/只。將其中一批用于血清溶血素實(shí)驗(yàn)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，另一批進(jìn)行免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子的測(cè)定。

1.3.2 免疫力增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 免疫器官指數(shù)測(cè)定

小鼠建模后連續(xù)灌胃30 d并稱體質(zhì)量，氯仿麻醉解剖，心室穿透取血1 mL，4 000 r/min離心10 min，分離血清并分裝，-80 ℃凍存。無(wú)菌條件下取小鼠胸腺和脾臟，及時(shí)稱質(zhì)量。免疫器官質(zhì)量與體質(zhì)量的比即為免疫器官指數(shù)。

1.3.2.2 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

建模30 d后，無(wú)菌條件下取小鼠脾臟，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗兩遍并研磨充分。取濾過(guò)液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，Hank's液洗2～3 遍。離心取沉淀，RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，活細(xì)胞比例不得低于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106個(gè)/mL。于96 孔板內(nèi)每孔加入90 μL細(xì)胞懸液和10 μL ConA溶液（終質(zhì)量濃度為5 mg/mL），置5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)68 h取出，每孔加入10 μL終質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h取出，吸棄上清液90 μL，每孔加入100 μL DMSO，待結(jié)晶紫溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD570nm）值。

1.3.2.3 小鼠溶血素水平的測(cè)定

建模26 d后，每組取4 只小鼠腹腔注射0.2 mL體積分?jǐn)?shù)2%的綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）進(jìn)行免疫，4 d后依照1.3.2.1節(jié)方法取血清。用生理鹽水將血清稀釋200 倍，取1 mL置于試管內(nèi)，依次加入體積分?jǐn)?shù)10%的SRBC 0.5 mL、豚鼠血清1 mL（豚鼠血清提前用PBS按照體積比1∶8稀釋）。另設(shè)置一不加血清的對(duì)照管（以PBS代替血清）。37 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，冰浴終止反應(yīng)，2 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入文齊氏試劑3 mL。同時(shí)另取一支試管測(cè)定半數(shù)溶血時(shí)的光密度值，加體積分?jǐn)?shù)10%的SRBC 0.25 mL，加文齊氏試劑至4 mL，充分混勻。將加文齊氏試劑的試管放置10 min后，于540 nm波長(zhǎng)處以對(duì)照管作為空白，分別測(cè)定各管的OD540nm值。依照公式（1）計(jì)算半數(shù)溶血值（HC50）。

1.3.2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）

建模30 d后，每組取4 只小鼠腹腔注射20%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL，間隔30 min，脫頸椎處死，仰位固定后，腹腔注射2 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min，吸出2 mL腹腔洗液，平均分滴于6 孔板兩個(gè)孔內(nèi)，編號(hào)后置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育30 min，加入2 mL無(wú)菌生理鹽水漂洗2 次，以除去未貼壁的細(xì)胞。晾干后，加入1 mL丙酮-甲醇（1∶1，V/V）溶液固定2 min，加入1～1.5 mL Giemsa工作液染色3 min，加入4 mL蒸餾水漂洗2 次，晾干。在400 倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每個(gè)孔計(jì)數(shù)100 個(gè)，按照下式（2）、（3）計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。1.3.3 血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、iNOS、NO分泌量的檢測(cè)

按照1.3.2.1節(jié)方法制備血清，采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ含量；以NOS試劑盒測(cè)定iNOS活力，酶活力單位（U）定義為每毫升血清每分鐘產(chǎn)生1 nmol NO；采用Griess法測(cè)定NO含量，嚴(yán)格按照試劑盒的操作規(guī)范進(jìn)行。

1.3.4 小鼠生長(zhǎng)性能及其血清中白蛋白、球蛋白含量和二者比值（白球比）的測(cè)定

記錄各組小鼠建模前、建模后、灌藥后15 d、灌藥后30 d、停灌后15 d的體質(zhì)量，對(duì)應(yīng)的4 個(gè)時(shí)間段分別記為建模期、灌胃前期、灌胃后期、停灌期，計(jì)算每個(gè)時(shí)間段的體質(zhì)量增加比（與前一階段的體質(zhì)量相比）。依照1.3.2.1節(jié)方法取血清，進(jìn)行白蛋白和血清總蛋白含量的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響

2.1.1 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，胸腺能夠產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺激素及激素類物質(zhì)，具有內(nèi)分泌機(jī)能［13］，脾臟是哺乳動(dòng)物最大的淋巴器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫［14］和體液免疫的中心。NLP中含有大量的納豆芽孢桿菌菌體，而胞壁糖、肽聚糖、糖蛋白［15］等菌體成分可作為抗原刺激免疫器官。由表1可知，RN3組小鼠的脾臟指數(shù)明顯高于R0組。與M組相比，除R0組和PN組外，其他組小鼠的脾臟指數(shù)均顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與M組相比，各組小鼠的胸腺指數(shù)均顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。這說(shuō)明抗生素的介導(dǎo)使小鼠的免疫器官指數(shù)下降，而NLP能夠?qū)ζ溥M(jìn)行調(diào)節(jié)和恢復(fù)，提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用。

2.1.2 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

淋巴細(xì)胞是特異性免疫的功能性細(xì)胞，它能釋放抗體，對(duì)外來(lái)的抗原進(jìn)行有效抵御。如圖1所示，C組、RN1～RN3組、P0組和PN組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子水平均極顯著高于M組（P＜0.01），而R0組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子水平顯著高于M組（P＜0.05），說(shuō)明NLP有助于提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子水平，有效調(diào)節(jié)或預(yù)防小鼠免疫低下水平。使用抗生素建模后，小鼠的抵抗力大幅度下降，當(dāng)灌胃NLP后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的分泌功能逐漸增強(qiáng)，RN1～RN3組小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子水平均高于R0組，且均極顯著高于M組，說(shuō)明NLP能夠調(diào)節(jié)小鼠脾淋巴細(xì)胞的分泌轉(zhuǎn)化，且效果明顯優(yōu)于灌胃生理鹽水（R0組）對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)。以上結(jié)果說(shuō)明NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用影響顯著。

2.1.3 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠血清溶血素水平的影響

用SRBC免疫后，小鼠血清出現(xiàn)溶血素（SRBC抗體），在補(bǔ)體豚鼠血清的作用下，發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，可根據(jù)血紅蛋白確定血清溶血素的含量，采用HC50反映小鼠機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。由圖2可知，對(duì)照組（N組）小鼠的HC50均極顯著低于其余各組（P＜0.01），RN1～RN3組小鼠的HC50均顯著或極顯著高于C組（P＜0.05或P＜0.01），且明顯高于R0組，說(shuō)明NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)作用。

2.1.4 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響

巨噬細(xì)胞能夠固定細(xì)胞或游離細(xì)胞殘片，吞噬消化病原體，并激活其他免疫細(xì)胞作用病原體，清除體內(nèi)的衰老或凋亡的細(xì)胞，以及免疫復(fù)合物和病原體等抗原性異物［16］。體內(nèi)腹腔巨噬細(xì)胞能夠吞噬外來(lái)抗原雞紅細(xì)胞，從而可以判斷巨噬細(xì)胞吞噬功能。由圖3A、B可知，與M組相比，吞噬指數(shù)與NLP的劑量成正比，吞噬百分率與NLP的劑量成反比，表明灌胃NLP后，小鼠腹腔中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)下降，被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)增加。由圖3C、D可知，被吞噬的雞紅細(xì)胞形態(tài)類似空泡且邊緣較整齊，細(xì)胞核隱約可見(jiàn)。與P0組相比，RN3組和PN組均能明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和提高巨噬細(xì)胞的吞噬百分率，RN1～RN3組和PN組能夠明顯增加雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)。以上結(jié)果說(shuō)明NLP具有很強(qiáng)的吞噬能力，能夠有效預(yù)防抗生素介導(dǎo)小鼠免疫能力低下的狀態(tài)。根據(jù)動(dòng)物免疫檢驗(yàn)方法［17］，以上結(jié)果表明NLP具有免疫增強(qiáng)作用。

2.2 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠細(xì)胞因子分泌功能的影響

細(xì)胞因子是介導(dǎo)抗體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的物質(zhì)，TNF-α是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的能殺傷腫瘤細(xì)胞和促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增生的細(xì)胞［18］。IL-10具有很強(qiáng)抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-γ及促炎因子的產(chǎn)生和釋放［19］。IFN-γ在效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)可以通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。這些細(xì)胞因子之間的交互作用能誘導(dǎo)其他相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)一系列細(xì)胞效應(yīng)，如提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用、加強(qiáng)T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性作用等［20］。

由表2可知，與C組相比，抗生素（M組）能極顯著降低小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的水平（P＜0.01），調(diào)節(jié)組小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的含量極顯著高于M組（P＜0.01）。與M組相比，調(diào)節(jié)組小鼠血清中IL-2、IL-10的釋放量極顯著增加（P＜0.01）。與M組相比，PN組能極顯著增加小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的釋放量（P＜0.01），且較P0組也可明顯增加TNF-α的釋放，調(diào)節(jié)TNF-α水平到正常水平。RN3組小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的水平顯著或極顯著低于C組（P＜0.05或P＜0.01），PN組IL-10的分泌量極顯著低于C組（P＜0.01），且低于P0組。NLP能夠通過(guò)調(diào)節(jié)IL-10的分泌，間接調(diào)節(jié)小鼠免疫能力低下的癥狀。以上結(jié)果表明NLP能有效預(yù)防小鼠的免疫能力低下，恢復(fù)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而提高小鼠免疫功能。

NOS能夠催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，通過(guò)測(cè)定光密度值即可計(jì)算出NOS活力。NOS可通過(guò)IFN-γ、TNF-α和脂多糖等刺激激活，生成高水平的NO，而多功能分子NO對(duì)NLRP3炎性體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答起負(fù)調(diào)控作用［21］。Griess法運(yùn)用NO在酸性條件下能夠與重氮鹽磺胺產(chǎn)生重氮反應(yīng)，然后與萘基乙烯基二胺發(fā)生偶合反應(yīng)，發(fā)生顏色變化且與NO含量成正比的原理來(lái)檢測(cè)NO水平。各組的iNOS的活力均極顯著高于M組（P＜0.01），而各組間無(wú)差異（P＞0.05）。RN2組和RN3組的NO水平極顯著高于M組（P＜0.01），RN3組的NO水平極顯著高于C組（P＜0.01），以上結(jié)果說(shuō)明NLP能夠有效調(diào)控NO的釋放進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫。

2.3 NLP對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，M組小鼠體質(zhì)量增加比在建模期、灌胃前期、灌胃后期均極顯著高于C組、調(diào)節(jié)組、預(yù)防組（P＜0.01），M組小鼠在停灌期的體質(zhì)量負(fù)增長(zhǎng)比也是最高的，這與Kim等［22］研究結(jié)果基本一致。建模期調(diào)節(jié)組和預(yù)防組由于灌胃抗生素溶液，導(dǎo)致小鼠腸道內(nèi)微生物大量死亡、腸道功能下降，小鼠體質(zhì)量不斷增加；灌胃前期調(diào)節(jié)組小鼠的體質(zhì)量增加比呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，說(shuō)明NLP能夠有效調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，從而部分恢復(fù)小鼠腸道功能；灌胃后期，PN組小鼠體質(zhì)量增加比呈負(fù)增長(zhǎng)，說(shuō)明NLP能夠通過(guò)恢復(fù)小鼠腸道正常功能而預(yù)防腸道菌群失調(diào)的狀態(tài)；停灌期由于NLP中的菌群繼續(xù)在小鼠腸道內(nèi)繁殖，有助于恢復(fù)小鼠腸道正常消化功能，小鼠體質(zhì)量減輕。在抗生素介導(dǎo)后，小鼠腸道由于益生菌的死亡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能及時(shí)被消化，小鼠腸道糞便積留，進(jìn)而影響小鼠腸道上皮細(xì)胞的免疫作用。

血清白蛋白和球蛋白是血清蛋白質(zhì)的一部分，它們能抵抗抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)來(lái)保護(hù)機(jī)體，白球比的變化反映機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱。免疫功能抑制或者降低會(huì)造成血清球蛋白降低，而白蛋白的降低會(huì)影響免疫力。由表3可知，模型組小鼠血清中的白蛋白、球蛋白和白球比的值均低于實(shí)驗(yàn)組，高劑量NLP調(diào)節(jié)組的白蛋白含量以及中劑量的NLP預(yù)防組的白蛋白和球蛋白的含量均高于空白對(duì)照組，說(shuō)明NLP能夠調(diào)節(jié)小鼠的血清蛋白的水平，從而調(diào)節(jié)抗生素介導(dǎo)小鼠免疫低下的水平。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用抗生素建立腸道菌群失調(diào)小鼠模型，研究納豆凍干粉對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用以及對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與模型組相比，RN1組能夠增加小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，RN1～RN3組能夠增加小鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌量，增強(qiáng)iNOS活力和小鼠血清中的白蛋白、球蛋白含量和白球比，RN1、RN3組能明顯增加小鼠血清中NO水平。各組的小鼠血清溶血素水平較對(duì)照組明顯升高。RN1～RN3組、PN組均能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用。與C組相比，調(diào)節(jié)組小鼠的半數(shù)溶血值升高。RN3組和PN組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞吞噬百分率、雞紅細(xì)胞的吞噬數(shù)增加。RN3組小鼠血清iNOS活力和白蛋白含量升高，PN組小鼠血清中白蛋白和球蛋白含量升高。與R0組相比，RN3能夠增加小鼠脾臟指數(shù)和提高IL-20的分泌，RN2、RN3能夠增加小鼠IL-2的分泌、巨噬細(xì)胞的吞噬功能和血清溶血素水平。與P0組相比，PN組小鼠TNF-α的釋放增加、巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)。綜合以上結(jié)果，高劑量的NLP（RN3組）對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用效果最佳。

建立腸道菌群失調(diào)模型后，小鼠腸道內(nèi)益生菌大量死亡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能被及時(shí)消化，導(dǎo)致小鼠腸道糞便積留，進(jìn)而影響小鼠腸道上皮細(xì)胞的免疫作用。NLP中的胞壁糖、肽聚糖等菌體成分可以作為抗原刺激免疫器官，促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原進(jìn)行抵御和吞噬消化，激活免疫細(xì)胞作用病原體。NLP能夠恢復(fù)小鼠細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而提高免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NLP具有免疫增強(qiáng)作用和增加細(xì)胞因子分泌的作用。研究表明，免疫功能與腸道菌群間存在著某種聯(lián)系［23-25］，而NLP對(duì)免疫功能和腸道菌群之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Lyophilized Natto Powder on Antibiotics-Mediated Immunomodulation and Cytokine Secretion in Mice

WU Gaofeng， HUANG Zhanwang*， LIU Wanling， NIU Liya， WANG Suzhen， HUANG Yongping
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food， College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

The effect of natto lyophilized powder （NLP） on antibiotics-mediated immunomodulation and cytokine secretion in SPF mice was explored in the present study. Totally 128 healthy mice were selected and divided randomly into 8 groups：control group （C）， four regulation groups （RN0， 1， 2 and 3）， two prevention groups （P0 and PN）， and model group （M）. The mice in all groups except C were administered with antibiotic solution for 3 days. Thereafter， the mice from group R0 were gavaged with normal saline， while those from group RN1， 2 and 3 were given NLP solution at three different dosages，respectively. The mice from the two prevention groups were continuously daily administered with antibiotic solution； 8 hour later， groups P0 and PN were respectively lavaged with normal saline and NLP solution. The mice in group M were simply given antibiotic solution during the entire administration period of 30 days. Immunomodulatory effects of NLP in mice and its effect on cytokine secretion were determined. Results showed that low-dose NLP resulted in a significant elevation in spleen and thymus indices in mice compared with the model group （P < 0.01）. The production of serum IL-2， IL-10， TNF-alpha，and IFN-gamma extremely significantly increased in groups RN1， RN2 and RN3 compared with the model group（P < 0.01）. In addition， the mice from the three prevention groups showed an extremely significant increase in inducible nitric oxide synthase （iNOS） activity in serum （P < 0.01）， and serum albumin and globulin concentrations and their ratio as well as serum NO level were significantly or extremely significantly higher in the mice from groups RN1 and RN3（P < 0.05 or P < 0.01）. The serum hemolysin levels in mice from the control， regulation and prevention groups were significantly higher than those in the group N （P < 0.01）. The phagocytic capacity of peritoneal macrophages from mice in groups RN1， RN2， RN3 and PN was significantly higher than that of group M. Compared with the control group， the half value of hemolysis （HC50） in groups RN1， RN2 and RN3 was significantly or extremely significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Groups RN3 and PN exhibited an extremely significant increase in the percentage of macrophages engaged in phagocytosis and the percent phagocytosis of chicken red blood cells （P < 0.01）. Therefore， NLP can enhance immune function and increase the secretion of cytokines.

natto lyophilized powder （NLP）； antibiotics； immunomodulatory effect

10.7506/spkx1002-6630-201609036

TS201.3

A

1002-6630（2016）09-0192-06

吳高峰， 黃占旺， 劉宛玲， 等. 納豆凍干粉對(duì)抗生素介導(dǎo)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用及細(xì)胞因子分泌的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（9）： 192-197. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609036. http：//www.spkx.net.cn

WU Gaofeng， HUANG Zhanwang， LIU Wanling， et al. Effect of lyophilized natto powder on antibiotics-mediated immunomodulation and cytokine secretion in mice［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 192-197. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609036. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-09

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160337）

吳高峰（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：w1989gf@126.com

*通信作者：黃占旺（1964—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：huangzw@163.com