陳小舉，操新民，姜紹通，李興江，*

（1.巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

氧化還原電位調(diào)控對鈍齒棒桿菌代謝通量分布的影響

陳小舉1，2，操新民2，姜紹通2，李興江2，*

（1.巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

研究不同氧化還原電位對鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵特性的影響，并對菌株的代謝通量分布特征進行了分析。結(jié)果表明，氧化還原電位由-56 mV降為-400 mV時，發(fā)酵液中琥珀酸質(zhì)量濃度由14 g/L上升為20.2 g/L，乳酸質(zhì)量濃度由44.9 g/L下降為35.2 g/L。代謝通量分析結(jié)果表明，降低氧化還原電位對6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點處的代謝流分布影響顯著。氧化還原電位為-400 mV時，胞內(nèi)戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，HMP）代謝通量與-56 mV相比增加了1.74 倍，由磷酸烯醇式丙酮酸流向C4途徑的代謝通量與-56 mV相比增加了78%，琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h），乳酸代謝通量由159.73 mmol/（L·g·h）下降為133.50 mmol/（L·g·h）。研究結(jié)果表明6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點是影響鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的關(guān)鍵節(jié)點，為后期通過菌種改造以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比、實現(xiàn)乳酸與琥珀酸聯(lián)產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

鈍齒棒桿菌；氧化還原電位；代謝通量分析；厭氧發(fā)酵

琥珀酸與乳酸是廣泛用于食品行業(yè)的有機酸［1-3］。鑒于食品安全，食品產(chǎn)業(yè)中所用的琥珀酸與乳酸多是通過發(fā)酵法生產(chǎn)的，這使得發(fā)酵法制備琥珀酸與乳酸具有十分廣闊的市場前景。

鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）發(fā)酵產(chǎn)精氨酸時，屬于有氧發(fā)酵過程［4］。許虹等［5］研究發(fā)現(xiàn)，供氧水平對鈍齒棒桿菌胞內(nèi)的代謝流分布影響較大。將鈍齒棒桿菌于無氧條件下培養(yǎng)時，琥珀酸與乳酸是其主要產(chǎn)物，但70%左右的葡萄糖會轉(zhuǎn)化為乳酸，而琥珀酸的產(chǎn)量相對較低，不利于乳酸和琥珀酸的聯(lián)產(chǎn)［6-7］。

由3-磷酸甘油醛生成磷酸烯醇式丙酮酸的過程伴隨1分子H還原力的釋放，理論上僅滿足由草酰乙酸至蘋果酸或者由富馬酸至琥珀酸所需的還原力，即：糖酵解途徑所產(chǎn)生的還原力僅滿足制備琥珀酸所需還原力的50%。因此，如果要繼續(xù)提高琥珀酸產(chǎn)量，增加微生物胞內(nèi)的H還原力水平是比較有效的方法之一。如Zheng Pu等［8］利用基因組改組技術(shù)得到菌株Actinobacillus succiniogenes F3-II-3-F，該菌株產(chǎn)琥珀酸的能力提高了73%，代謝通量分析結(jié)果顯示該菌株胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）通量增加是導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)量升高的主要原因。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加電子供體或電子受體來改變胞內(nèi)的氧化還原電勢可以用于調(diào)控胞內(nèi)的H還原力水平，從而影響到微生物的代謝特征。如Li Jian［9］、姜岷［10］等利用鐵氰化鉀和二硫蘇糖醇控制A. succinogenes厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸時的氧化還原電位水平，實現(xiàn)了對胞內(nèi)NADH/NAD+比的調(diào)控，使琥珀酸生產(chǎn)速率由0.75 g/（L·h）提高到1.18 g/（L·h）。

秦義等［11］認(rèn)為，在采用基因工程改造代謝網(wǎng)絡(luò)時，要準(zhǔn)確分析微生物代謝網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和特征，以便對其進行定向改造。代謝通量分析是代謝工程研究領(lǐng)域中的一種重要研究方法［12］，通過通量分析可以找到對目的產(chǎn)物影響較大的關(guān)鍵節(jié)點或者確定整個代謝過程中具有特殊地位的途徑或反應(yīng)。本實驗擬通過調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)基的氧化還原電位水平，對菌株在不同氧化還原電位水平下的代謝通量進行分析，考察不同氧化還原電位對鈍齒棒桿菌代謝流分布的影響，找出可以提高琥珀酸產(chǎn)量的關(guān)鍵節(jié)點，這對于后期通過改造菌種、優(yōu)化發(fā)酵過程以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比，實現(xiàn)乳酸與琥珀酸聯(lián)產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

鈍齒棒桿菌 CICC20219，購于中國工業(yè)微生物保藏中心，合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌株增殖培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L、尿素2 g/L、酵母浸粉 2 g/L、酪蛋白氨基酸 7 g/L、硫酸銨7 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸亞鐵6 mg/L、硫酸錳4.2 mg/L、生物素0.2 mg/L、硫胺素0.2 mg/L，pH 7.0，于0.1 MPa滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸亞鐵6 mg/L、硫酸錳4.2 mg/L、生物素 0.2 mg/L、硫胺素 0.2 mg/L，pH 7.0，于0.1 MPa滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 有氧培養(yǎng)富集菌體

將單菌落鈍齒棒桿菌接種于含30 mL增殖培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h以制備種子。吸取5 mL種子液接種于含150 mL增殖培養(yǎng)基的搖瓶中，在30 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)10 h，使生物量大量增加，然后將培養(yǎng)液于5 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體。

1.2.1.2 厭氧發(fā)酵產(chǎn)有機酸

將收集的菌體接種于含1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，每罐生物量干質(zhì)量濃度平均為5 g/L左右。通入CO2， 持續(xù)5 min后停止通入任何氣體，密封發(fā)酵罐，于30 ℃、150 r/min進行厭氧發(fā)酵，pH值為7.0，中和劑為MgCO3。每組實驗均重復(fù)3 次。

1.2.2 氧化還原電位控制

K3Fe（CN）6與Na2S·7H2O分別作為氧化劑與還原劑。發(fā)酵開始后，通過添加1 g/L的K3Fe（CN）6與10 mg/L的Na2S·7H2O分別將發(fā)酵液的氧化還原電位控制在原始水平（-56 mV）、-200 mV與-400 mV這3 種水平。發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液的氧化還原電位水平與最初設(shè)定的水平相差超過5 mV時，通過人工流加K3Fe（CN）6與Na2S·7H2O將其維持在設(shè)定水平。

1.2.3 代謝通量分析

代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法如文獻［13］所述，主要包括糖酵解（embden meyerhof parna，EMP）途徑、磷酸戊糖途徑、（pentose phosphate pathway，HMP）C4（由草酰乙酸到琥珀酸）途徑及乙醛酸循環(huán)。整個代謝網(wǎng)絡(luò)包含27 個代謝反應(yīng)（表1），其中第27號方程為維持細胞代謝的ATP消耗。鈍齒棒桿菌在厭氧培養(yǎng)時不再增殖，其生物量變化很小，因此，在通量計算過程中可以忽略生物量對代謝分布的影響［6-7］。如表2所示，中間代謝物為23 個，據(jù)此列出的代謝通量方程為27 個（表1），即變量數(shù)與代謝方程數(shù)分別為23與27，由此可知方程自由度為4，需測定4 個變量才能對方程求解。本研究可離線精確檢測4 個變量，分別是葡萄糖消耗速率及乳酸、琥珀酸和乙酸的生成速率，可檢測變量與自由度相等，表明代謝方程可求解。

1.2.4 檢測分析方法

發(fā)酵液樣品處理與代謝物精確檢測方法如文獻［13］所述。生物量采用干質(zhì)量法測定［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化還原電位調(diào)控對發(fā)酵結(jié)果的影響

微生物胞內(nèi)的多種代謝反應(yīng)都涉及電子的得失，因此，可以通過合適手段調(diào)控培養(yǎng)基的氧化還原電位以改變代謝網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的代謝流分布，使代謝反應(yīng)朝著有利于目標(biāo)產(chǎn)物積累的方向進行［15］。在本研究中，通過人為流加K3Fe（CN）6與Na2S溶液分別將發(fā)酵培養(yǎng)基的氧化還原電位控制在-56、-200 mV與-400 mV（-56 mV為發(fā)酵培養(yǎng)基最初氧化還原電位水平），以研究胞外不同氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1所示。由于鈍齒棒桿菌在厭氧條件下其生物量變化很小，因此，本研究中忽略了生物量變化對厭氧發(fā)酵結(jié)果的影響。

由圖1可知，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌在厭氧發(fā)酵條件下的葡萄糖代謝速率、乳酸與琥珀酸的產(chǎn)量影響較大。由1.2.1節(jié)可知，本研究是采用兩階段發(fā)酵法。在厭氧階段時，生物量平均為5 g/L左右，因此，在發(fā)酵開始后的4 h內(nèi)，3 種氧化還原電位下的葡萄糖利用速率都處于較高的水平（圖1A）。隨著發(fā)酵時間的延長，氧化還原電位對底物利用速率的影響開始顯現(xiàn)，降低氧化還原電位水平對葡萄糖利用速率產(chǎn)生不利影響。當(dāng)氧化還原電位由-56 mV變?yōu)?400 mV時，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中殘?zhí)呛坑?.3 g/L增加到17.0 g/L，葡萄糖平均利用速率同比下降19%。在降低氧化還原電位后，胞內(nèi)的NADH/NAD+比會升高［7］，而高水平的NADH/NAD+比會對糖酵解途徑中的3-磷酸甘油醛脫氫酶產(chǎn)生一定的抑制［16］，進而對葡萄糖利用速率產(chǎn)生不利影響。

降低氧化還原電位水平后，鈍齒棒桿菌利用的葡萄糖雖然減少，但發(fā)酵液中的琥珀酸終質(zhì)量濃度明顯增加。由圖1C可知，當(dāng)氧化還原電位處于-400 mV時，發(fā)酵液中琥珀酸終質(zhì)量濃度由14 g/L上升到20.2 g/L，與-56 mV相比，琥珀酸質(zhì)量濃度增加了44%，琥珀酸對葡萄糖的得率也由19.5%增加到32%。同時，乳酸質(zhì)量濃度由44.9 g/L降為35.2 g/L，與-56 mV相比，乳酸質(zhì)量濃度下降22%，其對葡萄糖的得率也由63%變?yōu)?9%（圖1B）。

氧化還原電位調(diào)控已成功用于對多種厭氧微生物的發(fā)酵過程進行代謝調(diào)節(jié)［17］。已有研究表明，微生物胞外的氧化還原電位變化會對胞內(nèi)的氧化還原電勢產(chǎn)生影響，主要體現(xiàn)為物質(zhì)代謝和能量代謝的變化［15，18］。在厭氧發(fā)酵過程中，發(fā)酵環(huán)境的氧化還原電位被人為降低以后會使胞內(nèi)還原電勢升高，微生物只有通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝反應(yīng)以產(chǎn)生還原力更強的代謝產(chǎn)物（如琥珀酸），才能降低胞內(nèi)的還原電勢以使胞內(nèi)氧化還原電勢重歸平衡。Sridhar［19］、Liu Rongming［20］等分別對Clostridium thermosuccinogenes、Escherichia coli進行研究時也發(fā)現(xiàn)低氧化還原電位水平更有利于琥珀酸的生產(chǎn)。

2.2 氧化還原電位對代謝通量的影響

鈍齒棒桿菌在厭氧發(fā)酵時主要利用C4途徑和乙醛酸循環(huán)生產(chǎn)琥珀酸，其中C4途徑對還原力的需求較大。已有研究結(jié)果表明，降低鈍齒棒桿菌發(fā)酵液中的氧化還原電位會增加其胞內(nèi)的可用還原力水平［7］，而還原力主要由HMP途徑與EMP途徑產(chǎn)生。通過代謝流分析，研究不同氧化還原電位水平下6-磷酸葡萄糖節(jié)點處的代謝通量分布變化，可以更深入地了解HMP途徑與EMP途徑對琥珀酸得率的影響，為進一步通過代謝調(diào)控提高琥珀酸得率以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸生成比，為實現(xiàn)乳酸與琥珀酸聯(lián)產(chǎn)提供依據(jù)。

本研究對比分析了鈍齒棒桿菌在-56、-200、-400 mV條件下的代謝通量分布變化。在通量計算過程中對結(jié)果進行了歸一化處理，所有代謝通量數(shù)據(jù)單位均為mmol/（L·g·h），即以100 mmol/（L·g·h）的葡萄糖為計算基準(zhǔn)。由于代謝通量計算的前提是：假設(shè)細胞內(nèi)的中間代謝物均處于擬穩(wěn)態(tài)，因此取發(fā)酵穩(wěn)定且菌體代謝旺盛時的發(fā)酵液以精確計算葡萄糖消耗速率及乳酸、琥珀酸、乙酸生成速率，并將其作為代謝通量常數(shù)項代入方程進行求解，更能準(zhǔn)確地比較分析鈍齒棒桿菌在氧化還原電位調(diào)控前后的代謝通量分布變化。本實驗取發(fā)酵時間6～8 h時間段的樣品進行代謝通量分析，代謝通量計算結(jié)果如表3所示。調(diào)控氧化還原電位對6-磷酸葡萄糖節(jié)點處的代謝流分布產(chǎn)生顯著影響，氧化還原電位越低，HMP途徑的代謝通量越大。氧化還原電位為-56 mV時，HMP途徑（J9）與EMP途徑（J2）的代謝通量比為9.89∶90.11，將氧化還原電位調(diào)為-400 mV時，HMP途徑與EMP途徑的代謝通量比增加為27.09∶72.91，HMP途徑代謝通量同比增加了1.74 倍。HMP通量增加后，磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點處的代謝通量分布也有較大變化。氧化還原電位調(diào)為-56 mV時，流向C4途徑的通量（J22）與流向丙酮酸的通量比為（J7）31.73∶164.97，表明多數(shù)葡萄糖用于乳酸的生成。氧化還原電位為-400 mV時，與-56 mV相比，流向C4途徑的代謝通量增加了78%，結(jié)果使琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h），同時，乳酸通量（J16）由159.73 mmol/（L·g·h）下降為133.50 mmol/（L·g·h），主要副產(chǎn)物乙酸的通量也下降了98%。

菌株產(chǎn)琥珀酸的代謝途徑主要是EMP途徑、HMP途徑、C4途徑及乙醛酸循環(huán)，已有研究結(jié)果表明C4途徑是該菌株產(chǎn)琥珀酸的主要代謝途徑，經(jīng)由C4途徑生產(chǎn)的琥珀酸占整個琥珀酸產(chǎn)量的93%以上［13］。利用C4途徑產(chǎn)琥珀酸，理論上每消耗1 mol葡萄糖可產(chǎn)生2 mol琥珀酸，需要4 mol NADH，而每摩爾葡萄糖經(jīng)由EMP途徑只產(chǎn)生2 mol的NADH［21-22］，即使考慮HMP途徑所產(chǎn)生的還原力（由于糖酵解途徑是菌株代謝葡萄糖的主要途徑），微生物胞內(nèi)的總NADH也處于不足的水平，所以NADH不足是鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵制備琥珀酸的核心矛盾之一。微生物胞內(nèi)的氧化還原態(tài)勢會受到外界環(huán)境變化的影響，氧化還原電位的改變會對胞內(nèi)的氧化還原態(tài)勢產(chǎn)生影響，主要表現(xiàn)為NADH/NAD+比的改變［23］。NADH及NAD+是3-磷酸甘油醛脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶及琥珀酸脫氫酶等關(guān)鍵酶的輔酶，因此，胞外氧化還原電位的調(diào)控會對微生物代謝產(chǎn)物的分布產(chǎn)生復(fù)雜影響，進而影響到菌株的整個代謝通量分布［6，17，24］。如本研究結(jié)果所示，降低氧化還原電位后，HMP代謝通量增加，細胞可以合成更多的NADPH，NADPH可以在轉(zhuǎn)氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為NADH，繼而用于產(chǎn)生更多的琥珀酸。結(jié)果表明，6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點是影響鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的關(guān)鍵節(jié)點，即對6-磷酸葡萄糖進行代謝調(diào)控可以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比。

3 結(jié) 論

微生物胞外的氧化還原電位變化會對胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和能量代謝產(chǎn)生影響。本實驗研究了不同氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵特性的影響并對其代謝通量分布進行了分析。發(fā)酵結(jié)果顯示，不同氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌在厭氧發(fā)酵條件下的葡萄糖代謝速率、乳酸及琥珀酸的產(chǎn)量影響較大，降低發(fā)酵液氧化還原電位水平對6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點處的代謝流分布影響顯著，使更多的碳源流向HMP途徑與C4途徑，以增加胞內(nèi)還原力的可用水平與琥珀酸產(chǎn)量，說明低氧化還原電位更有利于琥珀酸的產(chǎn)生。本實驗確定了6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點是影響鈍齒棒桿菌產(chǎn)琥珀酸的關(guān)鍵節(jié)點，即對6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點進行代謝調(diào)控可以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比，為后期通過菌種改造以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比、實現(xiàn)乳酸與琥珀酸聯(lián)產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Redox Potential Regulation on Metabolic Flux Distribution of Corynebacterium crenatum

CHEN Xiaoju1，2， CAO Xinmin2， JIANG Shaotong2， LI Xingjiang2，*
（1. College of Chemistry and Material Engineering， Chaohu University， Chaohu 238000， China；2. College of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

For the co-production of lactic acid and succinic acid， the effect of redox potential regulation on the fermentation

Corynebacterium crenatum； redox potential； metabolic flux analysis； anaerobic fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201609031

Q812

A

1002-6630（2016）09-0165-05

陳小舉， 操新民， 姜紹通， 等. 氧化還原電位調(diào)控對鈍齒棒桿菌代謝通量分布的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 165-169. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609031. http：//www.spkx.net.cn

CHEN Xiaoju， CAO Xinmin， JIANG Shaotong， et al. Effect of redox potential regulation on metabolic flux distribution of Corynebacterium crenatum［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 165-169. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609031. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（31470002）；安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重點項目（KJ2015A216）；巢湖學(xué)院科研啟動項目（KYQD-201402）

陳小舉（1984—），男，博士研究生，研究方向為生物資源綜合利用。E-mail：chenxiaoju2012@hotmail.com

*通信作者：李興江（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品發(fā)酵工程。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn

process of Corynebacterium crenatum was studied and the metabolic flux distribution was also analyzed. When the redox potential level was changed from -56 to -400 mV， the concentration of succinic acid in the fermented broth increased from 14 to 20.2 g/L；meanwhile， the concentration of lactic acid decreased from 44.9 to 35.2 g/L. The results of metabolic flux analysis indicated the metabolic flux distribution at the glucose 6-phosphate and phosphoenolpyruvate nodes were affected significantly. Compared with the value obtained at -56 mV， the flux of pentose phosphate pathway （HMP） pathway increased by 2.74 fold and the flux from phosphoenolpyruvate to oxaloacetate increased by 78%. As a result， the flux of succinic acid increased from 31.73 to 56.53 mmol/（L·g·h） and the flux of lactic acid decreased from 159.73 to 133.50 mmol/（L·g·h）. The results of this study demonstrated that glucose 6-phosphate and phosphoenolpyruvate were the key nodes that could affect the production of succinic acid by C. crenatum fermentation under anaerobic conditions， which has contributed to the co-production of lactic acid and succinic acid by manipulating wild-type C. crenatum to change the ratio of succinic acid/ lactic acid through metabolic engineering.